检测胎儿地中海贫血致病基因的方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种检测胎儿地中海贫血致病基因的方法，包括如下步骤：(1)筛选SNP位点，SNP位点用于设计扩增基因组地贫基因的引物池和捕获孕妇血浆中游离DNA地贫基因的探针；(2)提取孕妇血浆中游离DNA和父‑母‑已出生同胞三人的全血基因组DNA并构建相应的DNA文库，进行模板制备和富集；(3)对步骤(2)游离DNA和全血基因组DNA文库测序；(4)构建地贫基因上SNP位点的单倍体基因型，结合游离DNA和全血基因组DNA文库测序信息，分析父源遗传情况和母源遗传情况，以确定胎儿SNP位点相应的基因型。本发明专利技术通过目标区域捕获结合高通量测序技术，实现对地贫无创产前检测；所需的样本量少；该方法在对父源突变检测的基础上，可以实现对胎儿母源基因突变的检测。

【技术实现步骤摘要】
检测胎儿地中海贫血致病基因的方法和试剂盒
本专利技术涉及基因检测
，尤其是一种检测胎儿地中海贫血致病基因的方法和试剂盒。
技术介绍
地中海贫血(简称地贫)是全世界的高发遗传病之一，是由于人体α，β-珠蛋白基因突变或者缺失而导致α，β-珠蛋白肽链合成速率的不平衡，从而引起的溶血性贫血。地贫常见的两种类型是α-地贫和β-地贫，α-地贫相关基因为HBA2和HBA1，β-地贫相关基因为HBB。地贫集中在热带和亚热带地区，多发生于地中海沿岸国家，其次为中东、印度、巴基斯坦、东南亚、中国南方和北非，美国是移民国家，其发生率也较高。我国长江以南各省是地贫高发区，广东、广西、海南、台湾和香港等地受累人口超过2亿。目前地贫尚无根治的方法，只能使用输血治疗或脊髓移植，其价格昂贵且彻底治愈几率不高，因此产前筛查和诊断对预防该种出生缺陷疾病具有重大意义。目前临床报道产前检测地贫基因突变的方法有几种：传统的羊膜穿刺、腹绒毛活检等，这些有创伤性的操作可能导致胎儿损伤、流产或宫内感染等。1997年，卢煜明发现孕妇外周血浆中存在来自于胎儿的游离DNA，这一发现为通过孕妇外周血无创产前诊断和检测胚胎基因型提供了新的可能。已有报道利用孕妇血浆游离DNA与质谱、数字PCR、COLD-PCR等技术对地贫已成功进行无创检测。但这些方法是基于单一位点的PCR技术，由于血浆DNA含量低及高度片段化的特点，很可能会带来PCR的假阴性。除此以外，这些方法只能够检测与母亲不同的特异性父源突变是否存在，而无法进一步确定母源突变的存在情况。随着高通量测序技术的应用，孕妇血浆DNA无创产前检测胚胎染色体异常(如21、18、13染色体非整倍体变异)以及部分大的拷贝数变异已经成功应用于临床产前筛查和诊断。进一步地，通过高通量测序技术实现检测胎儿的家系中(指胎儿的父亲和母亲)基因型和单倍体型后，对孕妇血浆游离DNA的目标区域高通量测序，通过RHDO和SPRT等生物信息学方法实现对胎儿是否携带地贫相关基因变异的检测。高通量测序技术具有准确度高、通量大、样本需求量少、可以产生大量数据的特点。
技术实现思路
基于上述问题，本专利技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种高精确度的无创产前胎儿地中海贫血致病基因的检测方法，该方法不仅能够检测与母亲不同的特异性父源突变是否存在，还可以进一步确定母源突变的是否存在。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案包括以下几个方面：作为本专利技术的第一个方面，本专利技术提供一种检测胎儿地中海贫血致病基因的方法，包括如下步骤：(1)筛选SNP位点，所述SNP位点用于设计扩增基因组地贫基因的引物池和捕获孕妇血浆中游离DNA地贫基因的探针；(2)提取孕妇血浆中游离DNA和父-母-已出生同胞(指胎儿的姐姐或哥哥)三人的全血基因组DNA并构建相应的DNA文库，进行模板制备和富集；(3)对步骤(2)所述游离DNA和全血基因组DNA文库测序；(4)构建所述地贫基因上SNP位点的单倍体基因型，结合所述游离DNA和全血基因组DNA文库测序信息，分析父源遗传情况和母源遗传情况，以确定胎儿所述SNP位点相应的基因型。应当说明的是，该方法基于多重PCR和目标区域捕获技术，能对α&β-地中海贫血进行无创产前检测，即针对α-地贫的设计区域(chr16:60022-2233661)：下游(10Kb)+HBA基因+上游(10Kb)，以及针对β-地贫血设计区域(chr11:3236690-7177304)：下游(10Kb)+HBB基因+上游(10Kb)，利用dbSNP数据库筛选出SNP位点195个α-地贫SNP位点和275个β-地贫SNP位点，根据筛选的SNP位点分别设计地贫引物与探针，通过多重PCR技术对父-母-已育小孩基因组DNA进行文库构建，在通过目标区域捕获技术对母亲游离DNA进行文库构建；将所有构建好的文库进行高通量测序，将得到的测序数据与参考序列人类基因组hg19作比对，通过扩增基因组DNA地贫基因的引物池位点信息进行序列比对，利用GATK(3.4版本)得到父-母-已育小孩三人核心家系基因组DNA的SNP位点，以测序深度大于30×(倍)，测序碱基质量值大于Q20为筛选条件，筛选多态位点；再根据孟德尔遗传定律，把筛选得到的SNP基因型信息构建染色体单倍体型，并结合家系样本表型和已知突变型信息将致病突变关联到单倍体型上；通过与捕获游离DNA地贫基因的探针位点信息进行序列比对，得到母亲外周血游离DNA各SNP位点等位碱基的频率，通过父源和母源生物信息学分析胎儿遗传的父母单倍体型，从而确定胎儿基因型。优选地，所述步骤(2)和(3)中涉及DNA提取试剂，DNA纯化试剂，DNA文库构建试剂，DNA高通量测序试剂；DNA提取体系中提取游离DNA的血浆量不少于2mL，DNA纯化试剂为AgencourtAMPureXP-核酸纯化试剂盒。DNA文库构建试剂中基因组DNA模板不少于25ng，捕获血浆游离DNA文库模板不少于100ng；高通量测序体系选用IonTorrentProton测序平台进行测序。优选地，所述父源遗传分析中，筛选父亲杂合母亲纯合的基因型位点和父亲和母亲均为纯合且基因型不同的位点，在上述两类位点中，再筛选出孕妇血浆在上述位点中为杂合的位点，进行父源遗传分析。优选地，所述母源遗传分析中，在父源遗传情况分析基础上，筛选出父亲纯合母亲杂合的基因型位点，根据单倍型相对剂量(relativehaplotypedosage，RHDO)分析结合序贯概率比试验(sequentialprobabilityratiotest，SPRT)进行母源遗传分析。优选地，所述SNP位点的筛选条件为：在中国人千人基因组南方人和北方人数据库中同时MAF>＝20％，SNP位点上下100bp序列是特异区域，在基因组上没有同源性，并且45％<GC<70％，连续3个碱基不同。更优选地，所述SNP位点信息见表15。优选地，所述步骤(4)中，单倍体基因型的构建、父源遗传情况和母源遗传情况分析均使用NCBI数据库的hg19基因作为参考序列。优选地，所述步骤(4)中，单倍体基因型的构建包括以下步骤：1)构建父-母-已育小孩外周血基因组DNA的文库：包括目的基因(即HBA、HBB)的多重PCR扩增；引物的部分消化；扩增产物的接头连接；连接产物的纯化；最后的文库片段PCR扩增及纯化；2)将上述构建的文库进行高通量测序，将人类基因组hg19作为参考序列，通过与扩增基因组DNA地贫基因的引物池位点信息进行序列比对，利用GATK(3.4版本)得到父-母-已育小孩三人核心家系基因组DNA的SNP位点，以测序深度大于30×，测序碱基质量值Q大于20为筛选条件，筛选多态位点，再根据孟德尔遗传定律，把筛选得到的SNP基因型信息构建染色体单倍体型，并结合家系样本表型和已知突变型信息将致病突变关联到单倍体型上。其中，碱基质量值，简称Q值，是碱基读取错误率p的取整映射结果；目前，Q值与p值的对应关系有两种计算方式：标准Sanger变体计算方式以及早期Solexa管道(如IlluminaGenomeAnalyzer软件)计算方式。以标准Sanger变体方式为例，Q值被称为Phredq本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测胎儿地中海贫血致病基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)筛选SNP位点，所述SNP位点用于设计扩增基因组地贫基因的引物池和捕获孕妇血浆中游离DNA地贫基因的探针；(2)提取孕妇血浆中游离DNA和父‑母‑已出生同胞三人的全血基因组DNA并构建相应的DNA文库，进行模板制备和富集；(3)对步骤(2)所述游离DNA和全血基因组DNA文库测序；(4)构建所述地贫基因上SNP位点的单倍体基因型，结合所述游离DNA和全血基因组DNA文库测序信息，分析父源遗传情况和母源遗传情况，以确定胎儿所述SNP位点相应的基因型。

【技术特征摘要】
1.一种检测胎儿地中海贫血致病基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)筛选SNP位点，所述SNP位点用于设计扩增基因组地贫基因的引物池和捕获孕妇血浆中游离DNA地贫基因的探针；(2)提取孕妇血浆中游离DNA和父-母-已出生同胞三人的全血基因组DNA并构建相应的DNA文库，进行模板制备和富集；(3)对步骤(2)所述游离DNA和全血基因组DNA文库测序；(4)构建所述地贫基因上SNP位点的单倍体基因型，结合所述游离DNA和全血基因组DNA文库测序信息，分析父源遗传情况和母源遗传情况，以确定胎儿所述SNP位点相应的基因型。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述SNP位点的筛选条件为：在中国人千人基因组南方人和北方人数据库中同时MAF>＝20％，SNP位点上下100bp序列是特异区域，在基因组上没有同源性，并且45％<GC<70％，连续3个碱基不同。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述SNP位点信息见表2。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，单倍体基因型的构建、父源遗传情况和母源遗传情况分析均使用NCBI数据库的hg19基因作为参考序列。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，单倍体基因型的构建包括以下步骤：1)构建父-母-已育小孩外周血基因组DNA的文库：包括目的基因的多重PCR扩增；引物的部分消化；扩增产物的接头连接；连接产物的纯化；最后的文库片段PCR扩增及纯化；2)将上述构建的文库进行高通量测序，将人类基因组hg19作为参考序列，通过与扩增基因组DNA地贫基因的引物池位点信息进行序列比对，利用GATK得到父-母-已育小孩三人核心家系基因组DNA的SNP位点，以测序深度大于30×，测序碱基质量值Q大于20为筛选条件，筛选多态位点，再根据孟德尔遗传定律，把筛选得到的SNP基因型信息构建染色体单倍体型，并结合家系样本表型和已知突变型信息将致病突变关联到单倍体型上。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，父源遗传情况分析包括如下步骤：1)构...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴英松，李明，范冬梅，林圣，杨旭，侯荣基，
申请(专利权)人：广州市达瑞生物技术股份有限公司，南方医科大学，
类型：发明
国别省市：广东,44