检测红细胞Rh血型系统RHD1227A等位基因的HRM基因分型方法及引物技术方案

本发明专利技术公开了检测红细胞Rh血型系统RHD1227A等位基因的HRM基因分型方法及引物，具体涉及分子生物学技术领域，引物序列如下：HRM上游引物:ATATGGAAAGCACCTCATGA；HRM下游引物:AAACAGCAAGTCAACATATATACT，本发明专利技术操作简单，检测速度快，全部操作过程只需要约2.5小时，大大缩短了检测时间。该方法具有费用低、敏感性高、特异性高和重复性好等优点，可以准确、快速地进行分析，有利于在临床实践中推广应用。用。用。

【技术实现步骤摘要】
检测红细胞Rh血型系统RHD1227A等位基因的HRM基因分型方法及引物


[0001]本专利技术涉及分子生物学领域，具体涉及用于快速检测红细胞Rh血型系统 RHD*1227A等位基因HRM基因分型方法及引物。

技术介绍

[0002]Rh血型系统(ISBT004)是最复杂的人类血型系统之一，目前已发现超过 50种血型抗原，其中D抗原免疫原性最强，临床上可引起溶血性输血反应和严重的新生儿溶血病，具有重要的临床意义。D抗原是由RHD基因编码，根据红细胞膜上D抗原表达情况，可将D抗原血型分为D阳性、D阴性、D变异型和D放散型(D
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elute,DEL)。
[0003]Rh血型系统DEL型是日本学者Okobo于1984年在初筛为RhD阴性献血者中发现的一种RhD抗原表型，并逐渐受到人们的重视。DEL型个体红细胞膜上D抗原数量非常少，常规的血清学检测(盐水法和间接抗球蛋白试验)结果一般为阴性，其血型抗原表型只有通过敏感的吸收放散试验才能鉴定出来。由于吸收放散试验存在消耗抗体多、操作过程费时费力及对操作技能要求高等问题，所以吸收放散试验并未常规应用于临床检测。这些原因造成DEL血型个体一直未被鉴定出来，长期被作为RhD阴性个体对待。因此，常规检测结果为RhD阴性的个体其实可进一步分为RhD“真阴性”(红细胞表面不含D抗原，基因型为 d/d或其它RHD无效等位基因，不含RHD*1227A等位基因)和RhD“假阴性”(即 DEL血型，红细胞表面含少量D抗原，常规血清学方法检测不出来，其表型只能通过吸收放散试验才能检测出来)。超过95％的中国DEL型个体含纯合的 RHD*1227A等位基因(RHD*1227A/RHD*1227A基因型)或者杂合的RHD*1227A等位基因(RHD*1227A/d基因型)。
[0004]与白种人和黑种人中DEL型的罕见分布不同，在包括中国人群在内的东亚和东南亚人群中初筛常规检测结果为RhD阴性的个体中，有20
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30％为DEL血型。并且超过95％的中国DEL型个体的分子遗传基础是RHD*1227A等位基因(GenBank 序列号AF390110；含1227G>A突变，编号为rs549616139)。近年来研究发现，在中国汉族携带RHD*1227A等位基因的DEL人群中，其红细胞膜具有完整的D 抗原表位，因此这些DEL型个体可能不会被D抗原免疫而产生同种免疫反应，即输注RhD阳性血或孕有RhD阳性胎儿可能不会产生抗
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D。进一步临床研究也支持这一推测：104例产生抗
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D的孕妇中没有一例是携带RHD*1227A等位基因的DEL型个体，且44例携带RHD*1227A等位基因的DEL孕妇中没有一例产生抗
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D。到目前为止尚未有携带RHD*1227A等位基因的DEL型孕妇发生Rh新生儿溶血病的病例报道。因此，对常规血清学检测结果为RhD阴性的孕妇进行RHD*1227A 等位基因的准确鉴定，对于携带有RHD*1227A的DEL血型孕妇，可以减少孕期不必要的血型抗体的监测，也可以避免不必要的医疗干预来预防抗
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D产生(主要措施是注射昂贵及来源困难的抗
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D免疫球蛋白)。
[0005]目前DEL血型的血清学检测方法是吸收放散试验。吸收放散试验存在消耗抗体多、操作过程费时费力及对操作技能要求高等问题，不适用于临床大规模常规检测。
[0006]因此，专利技术用于快速检测红细胞Rh血型系统RHD*1227A等位基因HRM基因分型方法
及引物很有必要。

技术实现思路

[0007]为此，本专利技术实施例提供用于快速检测红细胞Rh血型系统RHD*1227A等位基因HRM基因分型方法及引物，通过采用PCR扩增后HRM分析的方法进行基因水平上的检测，可以灵敏且高精度检测突变等位基因的有无，以解决
技术介绍
中的问题。
[0008]为了实现上述目的，本专利技术实施例提供如下技术方案：检测红细胞Rh血型系统RHD*1227A等位基因HRM基因分型引物，包括PCR扩增引物，所述PCR扩增引物包括HRM上游引物和HRM下游引物，引物序列如下：
[0009]HRM上游引物:ATATGGAAAGCACCTCATGA；
[0010]HRM下游引物:AAACAGCAAGTCAACATATATACT。
[0011]检测红细胞Rh血型系统RHD*1227A等位基因HRM基因分型方法，包含以下成分：(1)PCR扩增引物一对；(2)PCR扩增试剂；(3)RHD*1227A/RHD*1227A 纯合阳性对照；(4)RHD*1227A/d杂合阳性对照；(5)d/d阴性对照；(6) 无DNA酶和RNA酶的ddH2O。
[0012]检测红细胞Rh血型系统RHD*1227A等位基因HRM基因分型方法，包括以下步骤：
[0013](1)从血清学常规检测结果为RhD阴性的外周血样本中提取基因组DNA，并将基因组DNA浓度标化到6ng/μl；
[0014](2)以基因组DNA为模板，用权利要求3所述的HRM上游引物和HRM下游引物进行PCR扩增获得扩增产物；
[0015](3)对扩增产物进行HRM分析，确定该样本是否携带RHD*1227A等位基因。
[0016]所述步骤(2)中PCR扩增反应体系总体积为20μl，体系中含有模板5.0 μl(6ng/μl)、Roche480High Resolution Melting MasterMix 10μl、HRM上游引物0.6μl、HRM下游引物0.6μl、无DNA酶和RNA酶的ddH2O 0.4μl、MgCl2(25mM)2.4μl和Spiking DNA 1.0μl。
[0017]所述Spiking DNA为不含RHD*1227A等位基因的RhD阳性且基因型为D/D 样本基因组DNA，并将基因组DNA浓度标化到6ng/μl。
[0018]所述步骤(2)中的PCR扩增的反应程序为：95℃预变性10分钟；95℃变性10秒，60℃退火15秒，72℃延伸10秒；循环扩增45次。
[0019]所述步骤(3)中PCR产物进行HRM分析的熔解温度设定是95℃变性1分钟， 40℃复性1分钟，然后以0.02℃/秒的速率从初始熔解温度65℃开始升温熔解至95℃，并在熔解过程中以25次/秒实时检测荧光信号；最后40℃冷却10秒。
[0020]本专利技术实施例具有如下优点：采用PCR扩增后HRM分析的方法进行基因水平上的检测，可以灵敏且高精度检测突变等位基因的有无。该方法无需序列特异性探针，操作简单，不仅具有灵敏度高、特异性好、成本低、检测速度快等优点，而且分辨率高，全部反应在封闭的反应管中完成，有效避免了交叉污染。由于Rh血型系统DEL型的分子遗传基础在不同种族间存在差异，本专利技术在相关研究的基础上，专门针对包括中国人在内的东亚人群RhD血型DEL型中最常见的RHD*1227A等位基因而设计。通过检测RHD*1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.检测红细胞Rh血型系统RHD1227A等位基因的HRM基因分型引物，其特征在于，包括PCR扩增引物，所述PCR扩增引物包括HRM上游引物和HRM下游引物，引物序列如下：HRM上游引物:ATATGGAAAGCACCTCATGA；HRM下游引物:AAACAGCAAGTCAACATATATACT。2.检测红细胞Rh血型系统RHD1227A等位基因的HRM基因分型方法，其特征在于：包含以下成分：(1)PCR扩增引物一对；(2)PCR扩增试剂；(3)RHD*1227A/RHD*1227A纯合阳性对照；(4)RHD*1227A/d杂合阳性对照；(5)d/d阴性对照；(6)无DNA酶和RNA酶的ddH2O。3.根据权利要求2所述的检测红细胞Rh血型系统RHD1227A等位基因的HRM基因分型方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)从血清学常规检测结果为RhD阴性的外周血样本中提取基因组DNA，并将基因组DNA浓度标化到6ng/μl；(2)以基因组DNA为模板，用权利要求3所述的HRM上游引物和HRM下游引物进行PCR扩增获得扩增产物；(3)对扩增产物进行HRM分析，确定该样本是否携带RHD*1227A等位基因。4.根据权利要求3所述的检测红细胞Rh血型系统RHD1227A等位基因的HRM基因分型方法，其特征在于：所述步骤(2)中PCR扩增反应体系总...

【专利技术属性】
技术研发人员：姬艳丽，王贞，温机智，
申请(专利权)人：广州血液中心，
类型：发明
国别省市：