筛查甲状腺乳头状癌相关融合基因的引物、探针和方法技术

本发明专利技术提供了一种一管式筛查甲状腺乳头状癌相关融合基因RET

【技术实现步骤摘要】
筛查甲状腺乳头状癌相关融合基因的引物、探针和方法


[0001]本专利技术涉及一种临床检验用途的基因检测方法，采用探针实时荧光PCR技术，对人类PTC中RET基因重排RET
‑
PTC1、RET
‑
PTC2、RET
‑
PTC3进行一管式筛查。
技术背景
[0002]甲状腺癌源于甲状腺内生长的恶性肿瘤或肿块，是最常见的内分泌恶性肿瘤，占所有人类恶性肿瘤的约4％，且甲状腺癌在全球范围内发病率在不断增加，全年龄段均可发病，20
‑
55岁为高发年龄。该发病率的增加主要归因于甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)。
[0003]RET基因是人类发现最早的致癌基因之一，也是第一个被提出作为肿瘤标志物的基因。RET原癌基因位于染色体10q11.2，编码一种跨膜酪氨酸激酶受体蛋白，在甲状腺滤泡旁细胞中高表达。RET
‑
PTC重排是染色体异位或臂内倒位导致的RET基因的3
’
端和其他基因的5
’
端基因结合产生的重排导致了此受体形成嵌合体而被活化，根据5
’
端基因的不同将重排分为多种类型，包括RET
‑
PTC1、RET
‑
PTC2、RET
‑
PTC3等13种之多。其中RET
‑
PTC1、RET
‑
PTC2、RET
‑
PTC3是重排类型中发病率最高，由RET基因分别和CCDC6(H4)、PRKAR1A、NCO4(ELE1)基因臂内倒位融合形成，所有融合包含完整的酪氨酸激酶受体，使RET
‑
PTC蛋白质能激活MAPK信号通路。
[0004]RET
‑
PTC在PTC中的重排率取决于肿瘤的组织学亚型、地域因素、检测方法以及辐射暴露史等。RET
‑
PTC早期被认为是PTC特有的标志物，但研究发现在甲状腺良性病变中也存在RET
‑
PTC重排，并与甲状腺结节的高生长率相关。因此，RET
‑
PTC不能作为PTC特有的标志物。一项纳入64例PTC患者的研究发现，RET重排阳性率仅为3.1％，与临床病理特征无明显相关性。该研究的缺点是研究对象较少，因而不能完全评估RET重排在RET中的表达率。也有研究发现，在有放射暴露史的人群中，RET重排率高达65％，在>45岁的患者中，RET基因重排频率明显低于<45岁的患者。目前RET重排在PTC中的检出率差异较大，可能与检测方法、种族及病例数有关。
[0005]RET
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PTC重排检测有助于甲状腺癌的诊断，克隆性RET
‑
PTC检测是预测乳头状癌的有力指标。目前的研究表明RET
‑
PTC重排除常见于甲状腺癌的中，也可见于甲状腺良性病变中，如桥本氏甲状腺炎等。
[0006]目前基因重排检测的常用技术有荧光原位杂交技术(FISH)、RT
‑
PCR等方法。FISH检测结果较为直观，但是试验过程繁琐，涉及试剂种类繁多，费时费力，且结果需经验丰富的专业人士来判读，结果判读存在较大的主观性。RT
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PCR采用Taqman探针荧光定量技术，综合生物学、酶学和荧光化学于一体，从扩增到结果分析均在PCR反应管封闭状态下进行，解决了PCR产物污染而导致假阳性的问题，同时也提高了敏感度，其结果用拷贝数表示，实现了对PCR产物的准确定量，易于统一标准，与定性PCR技术相比，具有特异度好，灵敏度高，线性关系好，操作简单，自动化程度高、防污染，有较大的线性范围等优点。能够满足RET
‑
PTC基因重排的检测，被认为是目前首选检测方法，用于评价治疗效果、预测预后。实时荧光定
量PCR中常见的方法有SYBR GreenI染料法，双探针杂交法以及Taqman技术等。其中SYBR GreenI由于是非饱和染料，特异性不如双探针杂交法以及Taqman法，必须通过观察溶解曲线来判断其特异性；而双探针杂交法成本又较为昂贵。因此本专利技术采用实时荧光PCR技术结合Taqman探针法应用于RET
‑
PTC基因重排检测。

技术实现思路

[0007]本专利技术设计了一种一管式筛查RET
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PTC基因3种常见重排类型RET
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PTC1、RET
‑
PTC2、RET
‑
PTC3的方法，包括：
[0008]1)检测RET
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PTC1、RET
‑
PTC2、RET
‑
PTC3基因的特异性引物及探针：
[0009]PTC1
‑
F GAGGAGAACCGCGACCTG
[0010]PTC2
‑
F GGCATCGACCGAGACAGCT
[0011]PTC3
‑
F CCTTACATACCCAGCACCGA
[0012]PTC
‑
R：CCGTTGCCTTGACCACTTTT
[0013]PTC
‑
probe：FAM
‑
TTCCAAGAACCAAGTTCTTCCGAGGG
–
TAMRA
[0014]2)检测内参基因Abl的特异性引物及探针：
[0015]Abl
‑
F:GATACGAAGGGAGGGTGTACCA
[0016]Abl
‑
R:CTCGGCCAGGGTGTTGAA
[0017]Abl
‑
Probe:FAM
‑
TGCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT
‑
TAMRA
[0018]3)将RET
‑
PTC1、RET
‑
PTC2、RET
‑
PTC3基因的引物及探针按合理的浓度比加入同一个PCR管中，并通过已优化的Real
‑
time PCR反应条件对样本进行检测，同时扩增内参基因Abl作参照。
[0019]进一步的，所述检测方法还包括如下步骤：
[0020]1)抽提样品RNA并反转录成cDNA
[0021]2)以cDNA为模板，依据所述的特异性扩增引物(PTC1
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F、PTC2
‑
F、PTC3
‑
F、PTC
‑
R)、检测探针(PTC
‑
probe)进行同管Real
‑
time PCR扩增，同时扩增内参基因Abl作参照；
[0022]3)根据Real
‑
time PCR结果来分析样本是否有本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一管式筛查RET
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PTC基因3种重排类型RET
‑
PTC1、RET
‑
PTC2、RET
‑
PTC3的引物和探针，其特征在于：对应的引物和探针的序列如下PTC1
‑
F：GAGGAGAACCGCGACCTGPTC2
‑
F：GGCATCGACCGAGACAGCTPTC3
‑
F：CCTTACATACCCAGCACCGAPTC
‑
R：CCGTTGCCTTGACCACTTTTPTC
‑
probe：FAM
‑
TTCCAAGAACCAAGTTCTTCCGAGGG
–
TAMRA。2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，还包括检测内参基因Abl的特异性引物及探针如下Abl
‑
F:GATACGAAGGGAGGGTGTACCAAbl
‑
R:CTCGGCCAGGGTGTTGAAAbl
‑
Probe:FAM
‑
TGCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT
‑
TAMR。3.一管式筛查RET
‑
PTC基因3种重排类型RET
‑
PTC1、RET
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PTC2、RET
‑
PTC3的方法，其特征在于，包括：(1)提供检测RET
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PTC1、RET
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PTC2、RET
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PTC3基因的特异性引物及探针：PTC1
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F：GAGGAGAACCGCGACCTGPTC2
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F：GGCATCGACCGAGACAGCTPTC3
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F：CCTTACATACCCAGCACCGAPTC
‑
R：CCGTTGCCTTGACCACTTTTPTC
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probe：FAM
‑
TTCCAAGAACCAAGTTCTTCCGAGGG
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TAMRA；(2)提供检测内参基因Abl的特异性引物及探针：Abl
‑
F:GATACGAAGGGAGGGTGTAC...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈雪青，裘振亚，王淑一，
申请(专利权)人：杭州艾迪康医学检验中心有限公司，
类型：发明
国别省市：