一种筛选抗人巨细胞病毒药物的方法及其应用技术

本发明专利技术涉及筛选抗人巨细胞病毒(HCMV)药物的方法及其应用，其特征在于利用HCMV可诱导人胚肺成纤维细胞内线粒体含量增加，其含量增加与HCMV的扩增具有显著的相关性，通过测定线粒体含量变化，计算药物对HCMV诱导的线粒体增量抑制率，可以有效的反映药物的抗HCMV作用，具有操作简便、检测灵活、反应灵敏和结果准确的特点。

【技术实现步骤摘要】
一种筛选抗人巨细胞病毒药物的方法及其应用
本专利技术属于生物
，具体是一种筛选抗人巨细胞病毒药物的方法及其应用。
技术介绍
人巨细胞病毒(humancytomegalovirus,HCMV)属疱疹病毒β亚科，在人群中感染普遍，尤其是免疫力低下的老年人、孕妇和新生儿，同时也是造成出生缺陷的重要因素。HCMV感染会导致神经系统、肝脏、呼吸系统及血液系统等损伤，严重时甚至危及生命(RevMedVirol,2010,20:311-326)。数据显示我国是HCMV感染的高发地区，儿童血清抗HCMV阳性率为83.2％-87.2％，成人则高达95％(国际检验医学杂志,2010,31:1131-1133)。因此，对巨细胞病毒感染者进行积极有效的治疗，是提高出生人口素质和提高免疫力低下老年人生活质量的重要手段。目前对于HCMV感染的治疗，仍缺少安全有效的抗HCMV感染的理想药物。尽管有一些临床用的核苷类抗病毒药物，如丙氧鸟苷、更昔洛韦和西多福韦等，以及其他类如膦甲酸等，有一定的临床疗效，但往往停药后HCMV又潜伏地回升，并且具有严重的不良反应，如骨髓抑制、肾毒性和引起电解质紊乱等，因此大大限制了其临床应用(微生物学免疫学进展,2015,43:64-68)。另外，HCMV疫苗的研发也没有实质性的进展，仍停留在研发阶段，未在临床上应用。因此，寻找新的安全有效的抗HCMV药物仍是一个研究热点。HCMV具有严格的寄生性，在体外培养中一般只在二倍体成纤维细胞上生长。传统的测定药物抗HCMV作用的主要手段有:(1)细胞病变(CPE)程度判定，主要通过肉眼进行显微镜的观察，每天记录细胞病变情况，需观察5-10天；(2)空斑计数试验，病毒扩增后引起空斑，进行染色，然后通过显微镜观察计数空斑形成的数目；(3)病毒滴度测定，结果准确，但操作非常繁琐；(4)病毒DNA复制及转录产物测定。这些指标可以用于检测单个或少数药物的抗HCMV活性，但对于用于筛选抗HCMV药物的存在不足：(1)人工操作过多(如通过显微镜观察)，评价细胞病变时主观差异性大，空斑计数误差也较大，缺乏客观定量数据，而且需要及时观察，观察时间有局限性；(2)对于空斑形成试验和病毒滴度测定，必须要等到HCMV复制到中晚期之后才能检测，周期长，操作繁琐；(3)直接测定病毒DNA拷贝数和转录产物结果精确，但操作步骤较多，检测成本也较高，可以用于抗HCMV活性的验证，但不适用于药物的筛选。另外，有研究者构建了一种HCMV-TOWNE-GFP重组巨细胞病毒，可以通过检测绿色荧光蛋白的表达来判断药物的抗HCMV作用(专利公开号：CN101319202A)，但在实际操作过程中，存在以下问题：1)检测结果客观性不足，绿色荧光蛋白的表达是通过肉眼判断其荧光强度，没有仪器给出的定量数据；2)需要活细胞状态下检测，必须及时观察，检测时间有局限性，且检测结果随细胞状态变化出现差异；3)需要配备倒置荧光显微镜。因此，目前仍缺少一种灵活、可靠、高效和快速的抗HCMV药物筛选方法。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种抗巨细胞病毒(HCMV)药物筛选方法，其主要测定指标是药物对HCMV诱导的线粒体增量抑制率，这是一种可以检测HCMV复制早期存在显著变化，并与病毒复制有着密切联系的指标，检测操作相对简单。其原理是基于HCMV诱导的人成纤维细胞线粒体含量增加与HCMVDNA和相关蛋白表达具有显著相关性，通过采用壬基吖啶橙(NAO)通过流式细胞仪进行测定线粒体相对含量，进而计算线粒体增量抑制率，可以有效反映药物的抗HCMV作用。本专利技术是通过以下技术方案实现的：1、细胞和病毒的培养：用10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基，在37℃、5％CO2条件下传代培养人胚肺二倍体成纤维细胞。将人巨细胞病毒Towne株接种于上述细胞，常规传代，用Reed-Muench法测定病毒滴度，-80℃冰箱保存。2、HCMV接种及药物干预：采用30PD的人胚肺二倍体成纤维细胞WI-38，用10％FBS的培养基按2×104/cm2接种至培养皿中，24h后更换0.2％FBS的培养基继续培养48h，通过此种血清饥饿的方法，细胞此时G0/G1同步化，更有利于HCMV的侵染。之后进行HCMV病毒(Towne病毒株)的接种，接种量为0.01MOI(感染复数)。设立加灭活HCMV的对照组(MOCK)，只加HCMV组(HCMV)和待测药物试验组(HCMV+TEST)，待测药物于HCMV接种前2小时加入到培养基中，于HCMV接种后指定时间进行相关检测。3、测定HCMV侵染后WI-38细胞线粒体数量：线粒体内膜心磷脂(CL)是一种线粒体的特异性成分，荧光探针壬基吖啶橙(NAO)能够特异性地与CL结合，进而应用流式细胞术方法检测细胞内线粒体数量的变化，是一个检测线粒体数量的有效指标。方法如下：上述HCMV侵染的WI-38细胞经胰酶消化收集后，加入预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)将细胞吹打成单个细胞，300g离心5分钟，PBS洗两遍，用约500μl的PBS重悬细胞，加入5ml预冷的70％乙醇，4℃固定过夜。检测前PBS洗两遍，沉淀细胞重悬于1ml的PBS中，加入终浓度为10μM的NAO染色液，常温避光染色10min，PBS洗涤两次，细胞经300目尼龙网过滤后，流式细胞仪测定FL1荧光强度(λex494nm，λem519nm)，每管计数5000-10000个细胞，采用CELLQuestPro进行数据分析。NAO荧光强度与线粒体数量成正比。该方法的优点：目前，通过流式细胞仪的5×8或者8×12的进样模块，可以一次性自动检测40管或者96管样本，大大减少了人工操作。另外，用于检测线粒体含量的样本是70％乙醇固定后的细胞，可在4℃或者-20℃至少保存1个月而检测结果依然稳定，在检测时间上比活细胞样本更为灵活。4线粒体增量抑制率的计算设对照组(MOCK，加失活HCMV)，单独HCMV组及HCMV+检测药物组(TEST)，以流式细胞仪测得的NAO荧光强度(FL1)，按下述公式计算，线粒体增量抑制率＝[1-(试验组-对照组)/(HCMV组-对照组)]*100％。以50％线粒体增量抑制率表示半数抑制浓度(IC50)<1mg/ml者为抗HCMV潜在活性药物。5治疗指数(TI)的计算对于上述获得的潜在阳性药物，采用MTT法检测其细胞毒活性，计算半数中毒浓度(TD50)，进而计算治疗指数(TI)＝TD50/IC50，取TI>10为候选物，进行抗HCMV活性的进一步验证。药物的细胞毒活性采用MTT法检测，方法如下：成纤维细胞以每孔3000个接种于96孔培养板中，培养24小时后加入含抑制HCMVDNA复制活性对应浓度的药物，每一浓度设6个平行孔，并设有不加药物的空白对照组和无细胞的溶解对照组。培养3天后,每孔加入20μlMTT(5mg/ml，用无血清的DMEM培养液配制)，37℃、5％CO2条件下培养4h，小心洗净孔内液体，每孔加150μlDMSO,在摇床上轻轻振荡10min,使结晶物充分溶解，而后于570nm处测定光吸收度(OD)。细胞存活率％＝(加药细胞OD-本底OD)/(对照细胞OD-本底OD)×100％。每检测点取3个平行孔本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种筛选抗人巨细胞病毒(HCMV)药物的方法，其特征在于其主要测定指标是药物对HCMV诱导的线粒体增加的抑制作用，通过计算药物对HCMV诱导的线粒体增量抑制率，反映药物的抗HCMV作用。

【技术特征摘要】
1.一种筛选抗人巨细胞病毒(HCMV)药物的方法，其特征在于其主要测定指标是药物对HCMV诱导的线粒体增加的抑制作用，通过计算药物对HCMV诱导的线粒体增量抑制率，反映药物的抗HCMV作用。2.如权利要求1所述的一种筛选抗人巨细胞病毒药物的方法，其特征在于采用0.01MOI的HCMVTowne株侵染28PD-35PD的WI-38细胞，采用壬基吖啶橙(NAO)染色后通过流式细胞仪进行测定线粒体含量，进而计算线粒体增量抑制率判断药物的抗HCMV作用。3.如权利要求1所述的一种筛选抗人巨细胞病毒药物的方法，其特征在于包括如下步骤：1)细胞和病毒的培养：用10％胎牛血清的DMEM培养基，在37℃、5％CO2条件下传代培养人胚肺二倍体成纤维细胞，将人巨细胞病毒Towne株接种于上述细胞，常规传代，用Reed-Muench法测定病毒滴度，-80℃冰箱保存；2)HCMV接种及药物干预：采用30PD的人胚肺二倍体成纤维细胞WI-38，用10％FBS的培养基按2×104/cm2接种至培养皿中，24小时后更换0.2％FBS的培养基继续培养48小时，之后进行HCMV病毒的接种，接种量为0.01MOI，设立加灭活HCMV的对照组，只加HCMV组和待测药物试验组，待测药物于HCMV接种前2小时加入到培养基中，于HCMV接种后指定时间进行相关检测；3)测定HCMV侵染后WI-38细胞线粒体数量：上述HCMV侵染的WI-38细胞经胰酶消化收集后，加入预冷的PBS缓冲液将细胞吹打成单个细胞，300g离心5分钟，PBS洗两遍，用500μl的PBS重悬细胞，加入5ml预冷的70％乙醇，4℃固定过夜，检测前PBS洗两遍，沉淀细胞重悬于1ml的PBS中，加入终浓度为10μM的NAO染色液，常温避光染色10min，PBS洗涤两次，细胞经300目尼龙网过滤后，流式细胞仪测定NAO荧光强度，每管计数5000-10000个细胞，采用CELLQuestPro进行数据分析，NAO荧光强度与线粒体数量成正比；4)线粒体增量抑制率的计算：设对照组，单独HCMV组及HCMV+检测药物组，以流式细胞仪测得的NAO荧光强度，按下述公式计算，线...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛根祥，严静，王国付，王三应，苏慧丽，代继桓，杨舟鑫，张婧，暴一众，
申请(专利权)人：浙江医院，
类型：发明
国别省市：浙江,33