利用自体免疫细胞制备视网膜色素上皮细胞薄片的方法技术

一种利用自体免疫细胞制备视网膜色素上皮细胞薄片的方法，包括如下步骤：S1、从病人自身外周血获取自体免疫细胞，经过体外去分化为多功能诱导干细胞；S2、将步骤S1得到的多功能诱导干细胞经定向诱导分化生成视网膜色素上皮细胞，从而制备得到视网膜色素上皮细胞薄片。本发明专利技术使用的RPE来源于病人自身免疫细胞，然后移植到同一个病人，这样降低病人的免疫排斥反应。除此之外，不存在组织配型和伦理方面的问题；因此，本发明专利技术试验在伦理方面和术后的结果，对开展此类临床试验都没有任何障碍。并且，此发明专利技术对黄斑病变的治疗有很好的前景。

【技术实现步骤摘要】
利用自体免疫细胞制备视网膜色素上皮细胞薄片的方法
本专利技术涉及细胞薄片的制备
，尤其涉及一种利用自体免疫细胞制备视网膜色素上皮细胞薄片的方法。
技术介绍
年龄相关性黄斑变性(age-relatedmaculardegeneration，AMD)是老龄化人群中最常见的致盲性眼病，属于视网膜退行性疾病的范畴，此类疾病的病理基础是视网膜神经元细胞的不可逆性损伤。目前常用的治疗手段：针对渗出性AMD的治疗目前有两大类：抗新生血管治疗和视网膜转位手术治疗。然而，前者需要长期使用才能抑制疾病；后者虽然修复了黄斑，但并不能防止疾病复发。针对萎缩性AMD目前尚无有效治疗手段。目前，视网膜色素上皮细胞(retinalpigmentepithelium，RPE)细胞移植为AMD患者治疗的新希望，RPE细胞移植是将具有正常结构和功能的RPE细胞移植至病损区，以替代被破坏了的RPE细胞，重建其功能。无论动物研究还是临床手术都发现，通过自体或异体RPE细胞移植来修复病变的RPE细胞均能挽救光感受器变性，不仅能延缓视力的进一步下降，还能促进视力的提高。然而，自体RPE细胞来源困难，数量有限，如何获得充足的低免疫排斥和成瘤性的RPE细胞也是目前亟待解决的问题。2015年，Schwartz等人以hESC-RPE细胞悬液已移植到萎缩性AMD和Stargardt‘s病患者体内，但细胞存活和视力恢复的程度尚不清楚。2018年，Kashani研究团队和Cruz研究团队在此基础上分别在ScienceTranslationalMedicine和naturebiotechnology都发表了一种hESC-RPE薄片用于AMD治疗，并对hESC-RPE薄片的有效性、成瘤性和移植手术的可行性进行了分析说明RPE移植治疗AMD是切实可行的。临床I期研究结果都发现hESC-RPE在移植后在视网膜下腔可以很好的存活，且患者视力得到明显的改善。但是，hESCs来源的RPE薄片在移植过后机体都会呈现免疫排斥，需长期使用免疫抑制药才能长期维持hESC-RPE存活保持疗效。除此之外，人胚胎干细胞并不是来源于流产的胚胎，也不会对胚胎构成损害，但社会伦理问题始终没有解决。因此，开发一种新的视网膜色素上皮细胞薄片的制备方法，不但具有迫切的研究价值，也具有良好的经济效益和工业应用潜力，这正是本专利技术得以完成的动力所在和基础。
技术实现思路
为了克服上述所指出的现有技术的缺陷，本专利技术人对此进行了深入研究，在付出了大量创造性劳动后，从而完成了本专利技术。具体而言，本专利技术所要解决的技术问题是：提供一种利用自体免疫细胞制备视网膜色素上皮细胞薄片的方法，以减少视网膜色素上皮细胞移植后的免疫排斥，同时避免社会伦理问题。为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案是：一种利用自体免疫细胞制备视网膜色素上皮细胞薄片的方法，包括如下步骤：S1、从病人自身外周血获取自体免疫细胞，经过体外去分化为多功能诱导干细胞；S2、将步骤S1得到的多功能诱导干细胞经定向诱导分化生成视网膜色素上皮细胞，从而制备得到视网膜色素上皮细胞薄片。本专利技术中，作为优选的技术方案，步骤S1中，从病人自身外周血获取自体免疫细胞包括如下步骤：首先将病人自身外周血利用生理盐水稀释，然后加在淋巴细胞分离液上，室温水平离心，分层；然后吸取白膜层(即免疫细胞)，洗涤细胞，每次混匀后离心，离心后弃去上清，收集自体免疫细胞。更详细的说，本专利技术中，作为优选的技术方案，步骤S1中，从病人自身外周血获取自体免疫细胞，步骤如下：采集病人自身外周血50ml，用TBD样本密度分离液(购自天津灏洋华科生物)，获取自体免疫细胞：1)将外周血50ml与生理盐水按1:1的比例稀释。将稀释后的血液小心地加在同等体积淋巴细胞分离液上，形成明显分层，室温水平离心1200rpm/min，20min。此时离心管中自上而下形成4层；血清、由免疫细胞构成的白膜层、淋巴细胞分离液层和最下面的红细胞沉淀层。2)用吸管小心吸取白膜层，尽量全部吸出免疫细胞。加2倍量生理盐水，洗涤细胞2次，每次混匀后离心、800rpm/min，10min。低速离心有利于去除细胞悬液中留存的血小板和淋巴细胞分离液，离心后弃去上清，收集自体免疫细胞。本专利技术中，作为优选的技术方案，步骤S1中，将自体免疫细胞体外去分化为多功能诱导干细胞，包括如下步骤：用RPMI(gibco)培养基得的免疫细胞进行过夜培养后，用分别带有转化因子OCT4、SOX2、KLF4和C-MYC的4种慢病毒对细胞进行转染，构建分别带有转化因子OCT4、SOX2、KLF4和C-MYC的四种质粒，经测序正确后备用；采用慢病毒包装试剂盒，将慢病毒包装细胞系293T接种于培养皿中，培养，利用得到的分别带有转化因子OCT4、SOX2、KLF4和C-MYC的四种质粒分别转染慢病毒包装细胞系293T，得到重组pLent-OCT4慢病毒、重组pLent-SOX2慢病毒、重组pLent-KLF4慢病毒、重组pLent-C-MYC慢病毒；将四种重组慢病毒按等浓度混匀，再将混匀后重组慢病毒感染免疫细胞，培养，得到多功能诱导干细胞。更详细的说，本专利技术中，作为优选的技术方案，步骤S1中，将自体免疫细胞体外去分化为多功能诱导干细胞，步骤如下：1)分别带有转化因子OCT4、SOX2、KLF4和C-MYC的4种慢病毒载体的构建OCT4(SEQIDNO.1)、SOX2(SEQIDNO.2)、KLF4(SEQIDNO.3)和C-MYC(SEQIDNO.4)的4种核酸人工序列委托生工生物工程(上海)有限公司分别合成并插入标准载体pUC上，因此命名为pUC-OCT4、pUC-SOX2、pUC-KLF4和pUC-C-MYC。同时将pUC-OCT4、pUC-SOX2、pUC-KLF4、pUC-C-MYC和pLent-C-GFP载体进行FastDigestAsiSI(购自ThermoFisher公司)和FastDigestNotI(购自ThermoFisher公司)双酶切，37℃，酶切20min。100μl酶切体系为：10×buffer：10μl；DNA6μg；AsiSI酶：3μl；NotI酶：3μl；去离子水补足体积。利用琼胶电泳分别把含有OCT4、SOX2、KLF4、C-MYCDNA片段和线性化的pLent-C-GFPDNA片段的琼胶部位切下，放在五个离心管中，采用DNAextractionkit(购自ThermoFisher公司)将DNA从琼胶中溶出，首先往上述离心管加入500μlDFbuffer，55℃作用10分钟，每2-3分钟摇晃一次，直至琼胶完全溶解。再将琼胶溶液全部吸入DFColumn，并套上CollectionTube，8000rpm离心1分钟，将过滤液倒掉。再加入500μlWashBuffer，8000rpm离心1分钟，过滤液倒掉。12000rpm离心2分钟确保乙醇被去除。最后将DFColumn转移至上另一干净的微量离心管，加入25μlElutionBuffer，室温静置2分钟后，14000rpm离心2分钟，微量离心管内的液体分别为纯化的OCT4、SOX2、KLF4、C-MYCDNA片段和线性化的pLent-C-GFPDNA片段。将上述OCT4、SOX2、KL本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用自体免疫细胞制备视网膜色素上皮细胞薄片的方法，其特征在于：包括如下步骤：S1、从病人自身外周血获取自体免疫细胞，经过体外去分化为多功能诱导干细胞；S2、将步骤S1得到的多功能诱导干细胞经定向诱导分化生成视网膜色素上皮细胞，从而制备得到视网膜色素上皮细胞薄片。

【技术特征摘要】
1.一种利用自体免疫细胞制备视网膜色素上皮细胞薄片的方法，其特征在于：包括如下步骤：S1、从病人自身外周血获取自体免疫细胞，经过体外去分化为多功能诱导干细胞；S2、将步骤S1得到的多功能诱导干细胞经定向诱导分化生成视网膜色素上皮细胞，从而制备得到视网膜色素上皮细胞薄片。2.如权利要求1所述的一种利用自体免疫细胞制备视网膜色素上皮细胞薄片的方法，其特征在于：步骤S1中，从病人自身外周血获取自体免疫细胞包括如下步骤：首先将病人自身外周血利用生理盐水稀释，然后加在淋巴细胞分离液上，室温水平离心，分层；然后吸取白膜层，洗涤细胞，每次混匀后离心，离心后弃去上清，收集自体免疫细胞。3.如权利要求2所述的一种利用自体免疫细胞制备视网膜色素上皮细胞薄片的方法，其特征在于：步骤如下：采集病人自身外周血50ml，用TBD样本密度分离液，获取自体免疫细胞：1)将外周血50ml与生理盐水按1:1的比例稀释，将稀释后的血液小心地加在同等体积淋巴细胞分离液上，形成明显分层，室温水平离心1200rpm/min，20min，此时离心管中自上而下形成4层；血清、由免疫细胞构成的白膜层、淋巴细胞分离液层和最下面的红细胞沉淀层；2)用吸管小心吸取白膜层，尽量全部吸出免疫细胞，加2倍量生理盐水，洗涤细胞2次，每次混匀后离心、800rpm，10min，离心后弃去上清，收集自体免疫细胞。4.如权利要求1所述的一种利用自体免疫细胞制备视网膜色素上皮细胞薄片的方法，其特征在于：步骤S1中，将自体免疫细胞体外去分化为多功能诱导干细胞，包括如下步骤：用RPMI(gibco)培养基得的免疫细胞进行过夜培养后，用分别带有转化因子OCT4、SOX2、KLF4和C-MYC的四种慢病毒对细胞进行转染，构建分别带有转化因子OCT4、SOX2、KLF4和C-MYC的四种质粒，经测序正确后备用；采用慢病毒包装试剂盒，将慢病毒包装细胞系293T接种于培养皿中，培养，利用得到的分别带有转化因子OCT4、SOX2、KLF4和C-MYC的四种质粒分别转染慢病毒包装细胞系293T，得到重组pLent-OCT4慢病毒、重组pLent-SOX2慢病毒、重组pLent-KLF4慢病毒、重组pLent-C-MYC慢病毒；将四种重组慢病毒按等浓度混匀，再将混匀后重组慢病毒感染免疫细胞，培养，得到多功能诱导干细胞。5.如权利要求4所述的一种利用自体免疫细胞制备视网膜色素上皮细胞薄片的方法，其特征在于：步骤如下：1)分别带有转化因子OCT4、SOX2、KLF4和C-MYC的四种慢病毒载体的构建OCT4、SOX2、KLF4和C-MYC的四种核酸人工序列合成并插入标准载体pUC上，命名为pUC-OCT4、pUC-SOX2、pUC-KLF4和pUC-C-MYC，同时将pUC-OCT4、pUC-SOX2、pUC-KLF4、pUC-C-MYC和pLent-C-GFP载体进行FastDigestAsiSI和FastDigestNotI双酶切，37℃，酶切20mi，100μl酶切体系为：10×buffer：10μl；DNA6μg；AsiSI酶：3μl；NotI酶：3μl；去离子水补足体积，利用琼胶电泳分别把含有OCT4、SOX2、KLF4、C-MYCDNA片段和线性化的pLent-C-GFPDNA片段的琼胶部位切下，放在五个离心管中，采用DNAextractionkit将DNA从琼胶中溶出，首先往上述离心管加入500μlDFbuffer，55℃作用10分钟，每2-3分钟摇晃一次，直至琼胶完全溶解，再将琼胶溶液全部吸入DFColumn，并套上CollectionTube，8000rpm离心1分钟，将过滤液倒掉，再加入500μlWashBuffer，8000rpm离心1分钟，过滤液倒掉，12000rpm离心2分钟确保乙醇被去除，最后将DFColumn转移至上另一干净的微量离心管，加入25μlElutionBuffer，室温静置2分钟后，14000rpm离心2分钟，微量离心管内的液体分别为纯化的OCT4、SOX2、KLF4、C-MYCDNA片段和线性化的pLent-C-GFPDNA片段；将上述OCT4、SOX2、KLF4、C-MYCDNA片段分别与线性化的pLent-C-GFPDNA片段在16℃进行过夜连接形成pLent-OCT4、pLent-SOX2、pLent-KLF4和pLent-C-MYC四种质粒，连接体系为：10×buffer：1μl；T4连接酶：1μl；目的基因DNA：4μl；线性化的pLent-C-GFPDNA：4μl；将上述pLent-OCT4、pLent-SOX2、pLent-KLF4和pLent-C-MYC四种质粒分别转化到E.coli(DH5α)，具体步骤如下：将质粒和感受态细胞混匀在冰上孵育半小时，再42度热激90秒，再冰上放置2min，最后加液体LB培养基缓摇1个小时左右再3000rpm离心5min，将100μl菌液涂布在含有氨苄LB固体平板；次日挑取单菌落进行过夜培养，采用质粒提取纯化试剂盒提取pLent-OCT4、pLent-SOX2、pLent-KLF4和pLent-C-MYC四种质粒，具体步骤如下：A.取1.5ml菌液室温10000g离心1min；B.去上清，加250μl溶液Ⅰ(含RNaseA)，涡漩振荡器震荡至菌体完全悬浮；C.加入250μl溶液Ⅱ，温和颠倒离心管4～6次，获得澄清的裂解液。最好室温孵育2min；D.加350μl溶液Ⅲ，温和颠倒数次混合，至出现白色絮状沉淀，室温10000g离心10min；E.特别小心吸取上清液，移至洁净的装配好容积2ml离心管的吸收柱中，要保证没有吸入沉淀和细胞碎片，室温10000g离心1min，至裂解物完全通过吸收柱；F.弃滤过液，加500μlBufferHBC，10000g离心1min，清洗吸收柱，除去残余蛋白质保证DNA的纯度；H.弃滤过液，再用100％乙醇稀释的750μlWashBuffer清洗吸收柱，10000g离心1min；I.再加750μlWashBuffer清洗吸收柱；J.必须将吸收柱10000g离心2min确保乙醇被去除；K.将吸收柱放入干净1.5ml离心管，加50-100μl无菌去离子水或TE缓冲液在滤膜上，10000g离心5min，收集质粒DNA；将上述的pLent-OCT4、pLent-SOX2、pLent-KLF4和pLent-C-MYC四种质粒进行测序，经测序正确后备用；2)四种慢病毒包装、滴度检测采用LentiviralPackagingKit慢病毒包装试剂盒，具体方法如下：将慢病毒包装细胞系293T接种于含有DMEM+10％FBS10cm培养皿中，37℃，5％的CO2条件下培养，贴壁率为70％-80％时准备转染；将pLent-OCT4、pL...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘明录，郭爱萍，韩国英，金海锋，刘玉，强邦明，冯建海，张传鹏，
申请(专利权)人：山东兴瑞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37