多酶催化制备纤维二糖的方法技术

本发明专利技术公开了一种纤维二糖的制备方法，属于纤维二糖的酶催化制备领域。本发明专利技术所公开的纤维二糖的制备方法以蔗糖或它的衍生物为底物，在一个多酶反应体系中，通过体外多酶高效催化将底物转化为纤维二糖；本发明专利技术通过使用新型高温酶剂并进行过程优化，从而建立优化的多酶反应体系，可以显著提升原料的转化效率和纤维二糖的得率。本发明专利技术方法原料转化率高，纤维二糖得率高，可实现纤维二糖的规模化生产。

Preparation of fiber two sugar catalyzed by multiple enzymes

The invention discloses a preparation method of fiber two sugar, belonging to the field of enzymatic preparation of fiber two sugar. The preparation method of the cellobiose disclosed in the present invention takes sucrose or its derivatives as substrates, converts the substrates into cellobiose in a multi-enzyme reaction system by in vitro multi-enzyme catalysis with high efficiency, and establishes an optimized multi-enzyme reaction system by using a novel high-temperature enzyme agent and optimizing the process. The conversion efficiency of raw materials and the yield of fiber two sugar were improved. The method has high conversion rate of raw materials, high yield of cellobiose, and can realize large-scale production of cellobiose.

【技术实现步骤摘要】
多酶催化制备纤维二糖的方法
本专利技术涉及纤维二糖的制备方法，尤其涉及多酶分子机器催化将蔗糖转化为纤维二糖的方法，属于纤维二糖的酶催化生产领域。
技术介绍
纤维二糖（cellobiose），学名4-O-β-D-葡萄吡喃苷基-D-葡萄吡喃糖，分子式C12H22O11，它是由两分子葡萄糖单元通过β-1,4糖苷键构成。它是纤维素水解的产物，也是纤维素的基本结构单元。纤维二糖被认为是“零热量”的甜味剂，其甜度约为蔗糖的30%左右。近年来，研究证明纤维二糖作为益生元可促进人体自身肠道内益生菌的生长与增殖，从而促进体内微生态的正向平衡，全面提高人体免疫力，因此其具有很好的医用开发前景。纤维二糖一定程度上还可以预防高脂血症、高血压病、心脏病、糖尿病、肥胖病等多种疾病。此外，纤维二糖还可作为饲料添加剂应用在水产养殖、畜牧业、家禽饲养业等领域，可以有效地降低饲料中抗生素的用量，提高了养殖效率。近年来，纤维二糖应用领域不断拓展，使得纤维二糖的消费量逐年上升，具有很大的市场潜力。随着世界经济状况的逐渐好转，生活水平的提高，纤维二糖的消费量还有继续增加的趋势。然而，由于目前纤维二糖的高售价，使得其市场前景还未得到充分的开发。中国是生产纤维二糖的主要国家之一，欧洲是目前主要的消费市场，主要用于保健品和食品饲料行业。预计今后一段时间内，纤维二糖的供应将更为紧缺，市场行情继续看好。目前纤维二糖的生产主要还是通过传统的高温水解或生物酶解纤维素类原料。其中，高温水解工艺设备材质要求严格，一次性投资大，且水解反应选择性低，水解产物组成复杂（含有纤维多糖等），粗产品精制工艺复杂，损失较多，生产成本较高，因此限制了原材料利用率的提高；同时，该工艺会产生大量的酸污染物，对水源，环境污染严重。目前研究纤维二糖生产的热点集中在微生物法、生物酶解法等，然而上述工艺均不同程度的存在原料成本高、产率低等问题。因此，亟待开发一种低成本、低污染、高产率的生产纤维二糖的新方法。针对上述问题，本专利提出了一种纤维二糖的酶催化转化方法，利用来源广泛且价廉的蔗糖作为底物，通过体外多酶分子机器催化的方法生产纤维二糖。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种纤维二糖的酶催化转化方法，通过多酶分子机器将蔗糖生产纤维二糖的方法，该方法具有纤维二糖产率和原料转化率高，生产成本低，无污染等优点。为解决上述技术问题，本专利技术所采取的技术方案是：本专利技术首先公开了一种纤维二糖的制备方法，包括以下步骤：（1）以蔗糖为底物，加入蔗糖磷酸化酶（Sucrosephosphorylase，EC2.4.1.7），葡萄糖异构酶（Glucoseisomerase，EC5.3.1.5）和纤维二糖磷酸化酶（Cellobiosephosphorylase，EC2.4.1.20）建立多酶分子机器反应体系，进行多酶分子机器催化反应。其中，步骤（1）中蔗糖的浓度为100mM；所述蔗糖磷酸化酶的用量为1.0U/mL，所述葡萄糖异构酶的用量为1.0U/mL，所述纤维二糖磷酸化酶的用量为1.0U/mL；所述酶催化反应的条件是在40~60℃下反应10~50小时。由于所述多酶反应体系涉及用酶均具有较好的热稳定性，因此所述多酶分子机器催化反应温度可提高到45℃以上，能够有效提高纤维二糖的得率和原料的转化效率；优选的，所述底物的浓度为100mM；所述蔗糖磷酸化酶的用量为1.0U/mL，所述葡萄糖异构酶的用量为1.0U/mL，所述纤维二糖磷酸化酶的用量为1.0U/mL；所述酶催化反应的条件是在45℃反应25小时。更优选的，为了进一步提高多酶分子机器催化反应的转化效率，可以通过优化催化体系的酶量比，提高中间产物转化效率，最终提高纤维二糖的转化效率；其中，所述优化的蔗糖磷酸化酶的用量为0.5U/mL，所述葡萄糖异构酶的用量为1.0U/mL，所述纤维二糖磷酸化酶的用量为1.5U/mL；所述酶催化反应的条件是在45℃反应15小时。所述多酶分子机器反应体系还含有以下各成分：缓冲液、无机磷酸盐、二价镁离子和锌离子或锰离子；各成分的用量为：优选的pH7.2的缓冲液100mM，无机磷酸根10~50mM，二价镁离子5mM；其中，所述无机磷酸根优选为10mM；所述缓冲液优选为HEPES缓冲液。所属多酶体系中蔗糖磷酸化酶和纤维二糖磷酸化酶均通过在大肠杆菌中重组表达获得。其中，蔗糖磷酸化酶来源于T.thermosaccharolyticum；纤维二糖磷酸化酶来源于C.thermocellum；优选的，为了提高重组蔗糖磷酸化酶在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达，可以通过对该基因进行全序列稀有密码子优化（序列信息见附件），其整体表达量相较野生型表达提高近4倍；更优选的，为了进一步提高蔗糖磷酸化酶在大肠杆菌BL21(DE3)中的可溶性表达，可以通过向优化的蔗糖磷酸化酶基因的特异性位点选择性插入同义稀有密码子（序列信息见附件），该优选基因的可溶性表达相较野生型提高了近5倍，这也为重组蔗糖磷酸化酶的表达纯化提供便利。本专利技术以蔗糖为底物，加入蔗糖磷酸化酶，葡萄糖异构酶和纤维二糖磷酸化酶，配制多酶反应体系，多酶分子机器催化途径包括：由蔗糖磷酸化酶将蔗糖中的一个葡萄糖单元转化为葡萄糖-1-磷酸并产生果糖；由葡萄糖异构酶将果糖转化为葡萄糖；由纤维二糖磷酸化酶将一个葡萄糖单元与葡萄糖-1-磷酸结合并转化为纤维二糖。该催化过程可以将蔗糖中所有的糖单元转化为纤维二糖，从而可以提高纤维二糖的得率和转化率。由于该催化体系反应可在高温条件（40~60℃）下进行，因此反应平衡偏向纤维二糖合成方向进行，相较常温酶催化体系该多酶体系能够实现更高的纤维二糖合成效率。本专利技术多酶反应体系中的任何一种酶还可以为任何一种具有同等功能的酶所替换，优选为通过蛋白质工程改造所获得的具有同等功能的赖高温突变酶。本专利技术体外多酶分子机器催化将蔗糖转化为纤维二糖试验中，在一个反应体系中，以蔗糖为原料，加入蔗糖磷酸化酶，葡萄糖异构酶和纤维二糖磷酸化酶，30℃进行催化反应25小时，最终蔗糖转化率为26.8%。在上述反应温度提高至45℃反应25小时，最终蔗糖的转化率达到61.2%，原料利用率显著提高。另外，通过调节多酶分子机器催化体系的酶量，优选的多酶反应体系蔗糖磷酸化酶、葡萄糖异构酶、纤维二糖磷酸化酶的酶量比0.5:1.0:1.5，可显著缩短整体反应时间至12小时，从而进一步提高纤维二糖的合成效率。本专利技术技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：本专利技术在一个多酶反应体系中，以蔗糖以及其衍生物为原料，通过体外多酶分子机器催化转化为纤维二糖，并通过新型高温酶制剂的选择、过程优化以及改变反应进程，使原料转化效率显著提高，高得率和高转化率又大大降低纤维二糖的分离成本。本专利技术方法具有简便，原料利用率高、纤维二糖转化率高，生产成本低，污染低等优点，可以实现纤维二糖的规模化生产。本专利技术所涉及到的术语及定义除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本专利技术所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。术语“酶催化反应”意指在生物催化剂-酶作用下进行的化学反应。附图说明图1为转化蔗糖生成纤维二糖的体外多酶分子机器催化途径的示意图；其中，SP，蔗糖磷酸化酶；GI，葡萄糖异构酶；CBP，纤维二糖磷酸化酶；图2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种纤维二糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）以蔗糖为底物，加入蔗糖磷酸化酶、葡萄糖异构酶、纤维二糖磷酸化酶建立多酶反应体系，进行酶催化反应；（2）反应后体系中包括纤维二糖、蔗糖和少量中间产物，将反应产物分离纯化，即得。

【技术特征摘要】
1.一种纤维二糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）以蔗糖为底物，加入蔗糖磷酸化酶、葡萄糖异构酶、纤维二糖磷酸化酶建立多酶反应体系，进行酶催化反应；（2）反应后体系中包括纤维二糖、蔗糖和少量中间产物，将反应产物分离纯化，即得。2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：重组蔗糖磷酸化酶是来源于高温厌氧菌Thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticum；重组纤维二糖磷酸化酶来源于嗜热菌Clostridiumthermocellum。3.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述多酶反应体系还含有以下成分：无机盐缓冲液、二价镁离子、无机磷酸盐等；其中，所述磷酸盐优选为磷酸二氢钠；更优选的，磷酸盐浓度控制在10mM左右每100mM蔗糖。4.按照权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：张以恒，钟超，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津,12