本发明专利技术公开了桃转录因子PpERF.A16及其应用。该基因属于ERF家族成员，其核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.1所示，编码区序列长度为966bp，编码321个氨基酸，其编码的氨基酸序列为序列表SEQ ID NO.2所示。在基因组和RNA SEQ分析的基础上，对乙烯生物合成基因、1‑氨基环丙烷‑1‑羧基合酶和氧化酶和AP2/ERF转录因子进行了分离和分析。经生物学功能验证，表明PpERF.A16基因具有促进乙烯合成的功能。PpERF.A16基因的发现，为促进乙烯合成的分子育种提供新的基因资源，为实施绿色农业提供新的遗传资源，该资源的开发利用有利提高桃果实的商品价值和市场竞争力，延长果实的货架期，有利于降低农业成本和实现环境友好。
【技术实现步骤摘要】
桃转录因子PpERF.A16基因、蛋白、其重组表达载体及应用
本专利技术涉及桃转录因子PpERF.A16基因、蛋白、其重组表达载体及应用，属于植物基因工程领域。
技术介绍
果实成熟是指在果实生长发育停止后发生的一系列生理生化反应的复杂有序过程，色泽、风味、香气、质地等多方面多会发生变化，并且果实成熟直接影响到果品的商品价值、采后储藏和市场竞争力。(Giovannoni，2004；Lietal.，2010；田世平，2013)。根据果实在成熟过程中是否出现出现呼吸峰，被分为呼吸跃变型和呼吸非跃变型(LeliEVreJ，1997)。番茄、苹果、香蕉、桃等在果实成熟过程中呼吸强度骤然上升，乙烯释放量增加，均为跃变型果实。葡萄、柑橘、草莓柠檬等在成熟过程中呼吸强度和乙烯释放量没有显著上升，均为非跃变型果实。乙烯是植物体内一种重要的内源激素。果实生长发育和成熟的过程都与乙烯有密切关系。乙烯合成基本途径：蛋氨酸(Methionine，Met)→S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，SAM)→1-氨基环丙烷-1-羧酸(1-aminocyclopropane-1-carboxylicacid,ACC)→乙烯。其中，ACC合成酶(ACS)和ACC氧化酶(ACO)是两个关键酶。(Hoffmanetal，1984；殷学仁，2009；韩延超，2016)。呼吸跃变型果实的成熟伴随大量乙烯释放。乙烯产生后，随即开启其信号转导之路。首先乙烯与受体结合(ETR)，ERF进一步激活下游的乙烯的三重反应(CTR)，EIN2(Ethyleneinsensitive2)和EIN3/EILs(Ethyleneinsensitive3/Ethyleneinsensitive3-like)位于CTR下游，是乙稀信号传导途径中的正调因子，可以结合乙烯响应因子ethyleneresponsefactor(ERF)的转录因子(ERFTFs)上游区域(AlexanderandGrierson2002；GuoandEcker2003；Solanoetal.1998,Guetal.2017)。ERF是乙烯信号转导途径上最后的调控因子，可以结合多个乙烯响应基因的启动子，从而调控乙烯反应。ERF家族是植物体特有的转录因子，广泛存在植物中。据报道ERF转录因子在植物的生长发育、果实成熟、新陈代谢和抗逆过程中发挥着重要作用。其主要特点是含有核定位信号、具有DNA结合功能的ERF/AP2结构域、转录调控功能。拟南芥中将ERF家族划为5个亚家族：ERF、AP2、DREB、RAV和其他。(Sakumaetal.,2002)。ERF蛋白作为转录因子可以通过特异性的结合启动子的顺式作用元件GCC-box、DRE/CRT来调控基因的表达(Ohme-TakagiandShinshi,1995；Solanoetal.,1998；Xiaoetal.,2013.韩延超,2016)。目前在番茄、香蕉、苹果、番木瓜、龙眼，猕猴桃等果实成熟过程中均有报道ERF作为乙烯信号转导途径的最后调控因子，可以直接调控下游基因，例如ACO、ACS、PG、EXP和PSY(Hanetal.2016；Leeetal.2012；Liuetal.2014.)。在番茄中，Tournier等人最早从番茄中分离出5个ERF基因,即LeERF1～LeERF4和LeERF3b(Tournieretal.,2003)。Zhang.等人已经验证了LeERF2可以结合LeACO3基因启动子中的GCC-box来调控并促进乙烯合成(Zhangetal.,2009)；在苹果中，MdERF3可以促进MdACS2的转录表达，MdERF2可以直接抑制MdACS2和MdERF3表达；(Lietal.,2016)；在番木瓜中，通过对ERFs进行qRT-PCR分析发现，CpERF2和CpERF3的表达在番木瓜成熟进程中变化非常明显，说明它们与番木瓜果实成熟有紧密联系(Lietal.,2013)；在香蕉中，MaERF9和MaERF11都可以通过结合MaACO启动子中GCC-box顺式作用元件分别促进和抑制MaACO的表达(Xiaoetal.,2013)。中国专利文献CN107686840A公开了从梨中分离克隆得到的PyERF3基因，用于促进梨果皮花青苷的生物合成。中国专利文献CN106047890A公开了调控柑橘果皮脱绿的关键乙烯响应因子CitERF6，可调控叶绿素降解。目前，针对桃果实成熟性状的研究还相对较少，仅参与调控桃果实软化性状的PG(polygalacturonase，多聚半乳糖醛酸酶)基因和参与调控桃果实成熟性状的乙烯上游合成基因ACS和ACO已获初步确认。而其它与桃果实成熟表型相一致的结构基因和转录因子至今尚无报道。因此，本研究通过对AP2/ERF基因家族的基因组和转录组数据以及PG、ACS和ACO基因家族的分析，试图分离出调控果实成熟的ERF基因。此外，通过农杆菌介导瞬时转法对桃果实中的ERF基因进行了沉默和过表达，并对其与成熟相关基因的相互作用进行了研究。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种与果实成熟相关的桃转录因子PpERF.A16基因，属于ERF家族成员，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，编码区序列(CDS)长度为966bp，编码321个氨基酸，编码的蛋白其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，等电点为5.05，分子量为79.72KD。本专利技术还提供了含有本专利技术所述PpERF.A16基因的重组表达载体。所述的重组表达载体，优选以pCAMBIA1301为出发载体，所述PpERF.A16基因的插入点为Xbal和HindIII之间。本专利技术还提供了含有本专利技术所述PpERF.A16基因的宿主菌。以及克隆本专利技术所述PpERF.A16基因的cDNA序列的引物对，上游引物PpERF.A16-F1序列如SEQIDNO.3所示，下游引物PpERF.A16-R1序列如SEQIDNO.4所示。本专利技术的另一目的是提供该基因的应用。包括PpERF.A16基因在促进桃乙烯合成中的应用。以及重组表达载体在促进植株乙烯合成中的应用。利用软件和转录组数据构建系统发育树并对相关基因进行qRT-PCR分析。利用qRT-PCR技术分析，PpACS.A1,PpACO.A1和PpERF.A16与果实成熟有关。构建PpERF.A16超表达载体和沉默载体，通过农杆菌介导瞬时转化桃果实中表明，pPr.A16的超表达和沉默分别增加和减少PpACS.A1,PpACO.A1基因的乙烯产量和表达水平。利用双荧光素酶报告基因系统分析了PpERF.A1和PpACS.A1,PpACO.A1基因的互做关系，结果表明PpERF.A1和PpACS.A1,PpACO.A1基因的启动子相互作用。利用酵母单杂交分析揭示了PpERF.A1通过结合它们的启动子介导PpACS.A1和PpACO.A1表达。与现有技术比，本专利技术具有以下优点和效果：PpERF.A16基因的发现，为促进乙烯合成的分子育种提供新的基因资源，为实施绿色农业提供新的遗传资源，该资源的开发利用有利于提高桃果实的商品价值，延长果实货架期，有利于降低农业成本和实现环境友好。附图说明图1为桃、苹果、草莓、木瓜、柑橘和葡萄本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.桃转录因子PpERF.A16基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.桃转录因子PpERF.A16基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.权利要求1所述的桃转录因子PpERF.A16基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。3.含有权利要求1所述PpERF.A16基因的重组表达载体。4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于：以pCAMBIA1301为载体，权利要求1所述的PpERF.A16基因的插入点为Xbal酶切位点和Hin...
【专利技术属性】
技术研发人员：张妤艳，谷超，郭志华，俞明亮，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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