本发明专利技术涉及一种PEG修饰胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶的制备方法，属于临床体外检测技术领域，其基本步骤为首先配置缓冲液，然后加入对氨基苯磺酸和AEO‑9两种物质作为激活剂，然后加入载体PEG20000（sigma），再加入保护剂以及乳化剂和离子物质搅拌均匀后，依次加入胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶，慢中速搅拌10分钟，然后使用低转速离心机离心后，取出上清液即可得到同等效果的PEG修饰酶。配方组成成分：PIEPES、对氨基苯磺酸、AEO‑9、PEG20000、保护剂、乳化剂、离子物质、胆固醇氧化酶、胆固醇脂酶、MIT，本方法操作简单、成本低，与PEG修饰酶法检测高密度脂蛋白胆固醇具有良好的兼容性。
【技术实现步骤摘要】
一种PEG修饰胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶的制备方法
本专利技术涉及一种PEG修饰胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶的制备方法，属于临床体外检测
技术介绍
PEG修饰酶法检测血清高密度脂蛋白胆固醇，由1995年Sugiuchi首先提出，属于均相法检测血高密度脂蛋白胆固醇的一种重要的方法，其方法的反应原理为试剂1中硫酸α-环糊精、硫酸葡聚糖与标本中的LDL、VLDL及CM形成水溶性复合物。试剂2中PEG修饰酶系对HDL发生反应，从而达到检测目的。本法原理着重点在于:①硫酸α-环糊精对富含apoB的LDL组分产生一种屏蔽作用；②PEG修饰酶中的PEG分子产生空间位阻,不利于大分子底物与酶接触,而又不影响小分子的HDL与酶发生酶促反应；③试剂2中的表面活性剂在不影响硫酸α-环糊精-LDL复合物的基础上能使HDL快速充分溶解。上述三点充分保证HDL测定的特异性和准确性。本法试剂非常优良，与CDC指定的比较方法具有非常好的相关性，本法能够实现对HDL充分、快速反应,对LDL的非特异性反应极少，抗干扰能力较强，结果较准确。但因技术难度较大,国内尚无产品问世，技术问题主要存在于修饰酶的合成与表面活性剂的筛选，其中最难以控制的就是PEG修饰酶的制备，Sugiuchi建立的方法为首先将PEG6000使用N-羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳二亚胺（DCCI）进行活化，将胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶，加入到0.1mol/L的HEPESPH=8.5的缓冲液，溶解完全后，将活化的PEG6000加入到酶溶液中，令PEG6000与酶通过共价键结合在一起，至少需要30分钟的时间，然后将PEG6000使用滤网将其过滤掉，然后使用HPLC方法进行检测结合后的酶的活性，作者通过大量的实验发现，本方法存在以下几个问题：①在PEG6000与酶结合的过程中，即使是PEG6000非常过量，但是也有少量的酶类没有被结合，这就在使用的时候为修饰酶的特异性增加了难度；②所激活PEG6000的两种物质，如果清理不当，会对后面HDL-C的检测造成影响，③如果没有结合酶的PEG过滤不够彻底，则会造成结果HDL-C的检测不准确，④修饰酶的过程过于繁杂，需要很高的技术和实验水平，修饰酶的获取成本高。因此基于以上的条件制约，影响了PEG-修饰酶法这种非常优良的检测方法的普及和推广，因此根据这些问题，专利技术了一种PEG修饰胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶的制备方法。
技术实现思路
本专利技术涉及一种PEG修饰胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶的制备方法。本专利技术是通过以下步骤得到的：1）基本原理：以PEG20000为载体，在激活剂以及离子物质存在的情况下，使胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶与PEG20000之间形成离子键，以获取具有对脂蛋白具有选择性的PEG修饰酶；2)基本步骤：首先配置缓冲液，然后加入对氨基苯磺酸和AEO-9两种物质作为激活剂，然后加入载体PEG20000（sigma），再加入保护剂以及乳化剂和离子物质搅拌均匀后，依次加入胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶，慢中速搅拌10分钟，然后使用低转速离心机离心后，取出上清液即可得到同等效果的PEG修饰酶；3)配方组成成分：PIEPES100mmol/LPH=7.0对氨基苯磺酸5mmol/LAEO-91.2g/LPEG20000（sigma）5G/L保护剂2ml/L-3ml/L乳化剂1ml/L-3ml/L离子物质3g/L-5g/L胆固醇氧化酶3KU/l胆固醇脂酶1KU/l防腐剂0.5g/L-1g/L。所述的一种PEG修饰胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶的制备方法，试剂中所述保护剂为磷脂血清；所述的一种PEG修饰胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶的制备方法，试剂所述乳化剂为曲拉通-100；所述的一种PEG修饰胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶的制备方法，试剂所述离子物质为氯化钠；所述的一种PEG修饰胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶的制备方法，试剂所述防腐剂为MIT。本专利技术的创新之处如下：1）本专利技术建立其一种操作简单的获取PEG修饰胆固醇氧化酶和PEG修饰胆固醇脂酶的制备方法，由原来的共价结合，改为离子结合；2）在试剂中选取了分子量较大的PEG20000作为载体，即使是有未被活化的PEG20000加入到试剂中也不会造成影响试剂的反应；3）在试剂中加入对氨基苯磺酸和AEO-9能够较好激活PEG20000，且不会对酶活性以及高密度脂蛋白胆固醇的检测造成影响；4）乳化剂曲拉通100和氯化钠则能增加酶与激活后的PEG20000的结合；5）磷脂血清则能够提高产品PEG-修饰酶的稳定性，而MIT防腐剂的选择则能够较好的抑制细菌的生长。附图说明图1为实施例3试剂检测方法；图2为实施例1与和实施例2分别与对照组PEG修饰酶检测结果比较；图3为实施例1与对照组PEG修饰酶相关性；图4为实施例2与对照组PEG修饰酶相关性。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的说明：实施列1一种PEG修饰胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶的制备方法。1)基本步骤：首先配置缓冲液，然后加入对氨基苯磺酸和AEO-9两种物质作为激活剂，然后加入载体PEG20000（sigma），再加入保护剂以及乳化剂和离子物质搅拌均匀后，依次加入胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶，慢中速搅拌10分钟，然后使用低转速离心机离心后，取出上清液即可得到同等效果的PEG修饰酶。2)配方组成成分：PIEPES100mmol/LPH=7.0对氨基苯磺酸5mmol/LAEO-91.2g/LPEG20000（sigma）5G/L磷脂血清2ml/L曲拉通-1001ml/L氯化钠3g/L胆固醇氧化酶3KU/l胆固醇脂酶1KU/lMIT0.5g/L。实施例2本实施例描述的是一种原料增加后的新型的PEG修饰胆固醇氧化酶和PEG修饰胆固醇脂酶的制备：制备步骤：1）首先配置缓冲液，然后加入对氨基苯磺酸和AEO-9两种物质作为激活剂，然后加入载体PEG20000（sigma），再加入保护剂以及乳化剂和离子物质搅拌均匀后，依次加入胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶，慢中速搅拌10分钟，然后使用低转速离心机离心后，取出上清液即可得到同等效果的PEG修饰酶。2)配方组成成分：PIEPES100mmol/LPH=7.0对氨基苯磺酸5mmol/LAEO-91.2g/LPEG20000（sigma）5G/L磷脂血清3ml/L曲拉通-1003ml/L氯化钠5g/L胆固醇氧化酶3KU/l胆固醇脂酶1KU/lMIT1g/L。实施例3本实施例描述的是将实施例1、2方法获取的PEG修饰酶与Sugiuchi方法获取的PEG修饰酶进行临床应用检测结果比较。1）配置PEG修饰酶方法的高密度脂蛋白检测试剂配置方案：本方案为双试剂:试剂R1:MOPS缓冲液30mmol/L,PH7.0；a-环状葡聚糖硫酸盐0.5mmol/L；硫酸葡聚糖0.5g/L；氯化镁2mmol/L；EMSE0.3g/L。试剂R2:MOPS缓冲液30mmol/L,PH7.0；PEG修饰胆固醇脂酶1KU/L；PEG修饰胆固醇氧化酶5KU/L；过氧化物酶30KU/L；4-AA0.5g/L。2)检测比较：将实施例1和实施2作为实验组，以Sugiuchi方法描述制备的PEG修饰酶作为对照组，按照PEG修饰酶法高密度脂蛋白胆固醇检测试剂的配置方法，作为原材料加入使用，在使用时采用具有本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种PEG修饰胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶的制备方法如下：1）基本原理：以PEG20000为载体，在激活剂以及离子物质的存在的情况下，使胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶与PEG20000之间形成离子键，以获取具有对脂蛋白具有选择性的PEG修饰酶；2)基本步骤：首先配置缓冲液，然后加入对氨基苯磺酸和AEO‑9两种物质作为激活剂，然后加入载体PEG20000（sigma），再加入保护剂以及乳化剂和离子物质搅拌均匀后，依次加入胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶，慢中速搅拌10分钟，然后使用低转速离心机离心后，取出上清液即可得到同等效果的PEG修饰酶；3)配方组成成分：PIEPES 100mmol/L PH=7.0对氨基苯磺酸 5mmol/LAEO‑9 1.2g/LPEG20000（sigma） 5G/L保护剂 2ml/L‑3ml/L乳化剂 1ml/L‑3 ml /L离子物质 3g/L‑5g/L胆固醇氧化酶 3KU/l胆固醇脂酶 1KU/lMIT 0.5g/L‑1g/L。...
【技术特征摘要】
1.一种PEG修饰胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶的制备方法如下：1）基本原理：以PEG20000为载体，在激活剂以及离子物质的存在的情况下，使胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶与PEG20000之间形成离子键，以获取具有对脂蛋白具有选择性的PEG修饰酶；2)基本步骤：首先配置缓冲液，然后加入对氨基苯磺酸和AEO-9两种物质作为激活剂，然后加入载体PEG20000（sigma），再加入保护剂以及乳化剂和离子物质搅拌均匀后，依次加入胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶，慢中速搅拌10分钟，然后使用低转速离心机离心后，取出上清液即可得到同等效果的PEG修饰酶；3)配方组成成分：PIEPES100mmol/LPH=7.0对氨基苯磺酸5mmol/LAEO-91.2g/LPEG20000（sigma）5G/L保护剂2ml/L-3ml/L乳化...
【专利技术属性】
技术研发人员：罗维晓，魏海明，王美丽，胡晓飞，
申请(专利权)人：山东博科生物产业有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37
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