一种催化效率提高的L-乳酸脱氢酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种催化效率提高的L‑乳酸脱氢酶突变体及其应用，属于基因工程技术领域。本发明专利技术在L‑乳酸脱氢酶基础上，通过定点突变生物技术改造L‑乳酸脱氢酶分子结构，得到一株L‑乳酸脱氢酶大肠杆菌工程菌，突变酶比酶活提高5.2倍，催化活性提高3.8倍。本发明专利技术解决了L‑乳酸脱氢酶催化活性低的限制性问题，为L‑乳酸脱氢酶分子改造提供了一条新的思路。

A L- lactic acid dehydrogenase mutant with improved catalytic efficiency and its application

The invention discloses a mutant of L_lactate dehydrogenase with improved catalytic efficiency and its application, belonging to the field of genetic engineering technology. On the basis of L_lactate dehydrogenase, the molecular structure of L_lactate dehydrogenase is modified by site-directed mutagenesis biotechnology, and an engineered E. coli strain of L_lactate dehydrogenase is obtained. The mutagenesis enzyme activity is 5.2 times higher than the enzyme activity, and the catalytic activity is 3.8 times higher. The invention solves the limitation problem of low catalytic activity of L_lactate dehydrogenase and provides a new idea for the molecular modification of L_lactate dehydrogenase.

【技术实现步骤摘要】
一种催化效率提高的L-乳酸脱氢酶突变体及其应用
本专利技术涉及一种催化效率提高的L-乳酸脱氢酶突变体及其应用，属于基因工程

技术介绍
NADH依赖型L-乳酸脱氢酶(L-lactatedehydrogenase，L-LDH)能够不对称还原α-酮酸生成手性α-羟基酸，其广泛应用于生物制药、材料和食品等行业。例如L-苯乳酸(L-phenyllacticacid)是一种天然抑菌剂，也可由L-LDH不对称还原苯丙酮酸(phenylpyruvicacid，PPA)催化生成，可以替代食品添加剂和动物饲料中的抑菌剂，也可以作为合成多种药物的前体，还可以作为一种潜在的聚乳酸替代物，合成聚苯乳酸新型高分子材料。一些化学和生物方法可用于合成手性α-羟基酸，但与化学法相比，生物酶法由于其条件温和，环境友好，生成产物纯度高等优点，已成为主要合成方法。但现已发现的大多数野生型L/D-LDH对带有长脂肪链或芳香基团侧链的底物(苯甲酰甲酸，PPA，草酰乙酸等)表现出较低的活性，在一定程度上限制了L/D-LDH的广泛应用。随着人们对L/D-LDH的结构、功能和作用机理的认识不断深入，采用基因工程技术改造酶分子以获得具有优良酶学性质的L/D-LDH的研究得到了迅速发展。Jiang等采用定点突变方法将PseudomonasstutzeriSDML-LDH中的Val108替换为Ala，获得一个新突变酶，该突变酶对L-扁桃酸的催化效率(kcat/Km)较野生型酶提高了50.1倍。Zheng等在L.bulgaricusATCC11842D-LDH的基础上，将其52位点的Tyr突变为Leu，使得突变酶对PPA的活性显著提高。Aslan等对Geobacillusstearothermophilus的L-LDH(BsLDH)实施了定点饱和突变，从突变文库中，获得了一个最优突变体1G7(D101Y102)，其催化PPA的活性明显高于BsLDH。本专利技术采用单点突变技术，基于同源建模方法，通过突变特定氨基酸优化L-乳酸脱氢酶分子结构、提高其催化活性。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种催化活性提高的L-乳酸脱氢酶突变体及其构建方法。本专利技术提供一种催化活性提高的L-乳酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列是SEQIDNO.1所示的序列。所述突变体的核苷酸序列是SEQIDNO.3所示的序列。所述突变体是在如序列SEQIDNO.2所示的氨基酸的基础上，将第88位的谷氨酰胺突变成了精氨酸(Q88R)。所述编码SEQIDNO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列是SEQIDNO.4所示的序列。本专利技术还提供一种表达所述L-乳酸脱氢酶突变体的基因工程菌。所述基因工程菌的制备方法，是以携带编码L-乳酸脱氢酶基因的重组质粒为模板，设计并合成引物，通过PCR进行定点突变，得到携带编码突变体基因的重组质粒，将重组质粒转化到大肠杆菌BL21中即得到重组大肠杆菌基因工程菌。所述表达载体是以下任意一种：pET-22b(+)、pET-28a(+)、pET-32a(+)、pET-41a(+)。所述表达载体，在本专利技术的一种实施方式中是pET-22b(+)。所述大肠杆菌宿主菌是以下任意一种：E.coliBL21、E.coliJM109、E.coliDH5α、或E.coliTOP10。所述大肠杆菌宿主菌，在本专利技术的一种实施方式中是E.coliBL21。所述的制备方法，具体是：(1)以携带序列如SEQIDNO.4所示Lcldh基因的重组质粒pET-22b(+)-Lcldh为模板，序列如SEQIDNO.5所示的F1primer、序列如SEQIDNO.6所示的R1primer为引物，进行突变PCR，即得到编码的第88位氨基酸由谷氨酰胺突变成了精氨酸的重组质粒pET-22b(+)-LcldhQ88R；(2)将上一步得到的重组质粒转化至E.coliBL21(DE3)，获得重组大肠杆菌基因工程菌LcLdhBL21。本专利技术在L-乳酸脱氢酶基础上，通过定点突变生物技术改造L-乳酸脱氢酶分子结构，得到一株L-乳酸脱氢酶大肠杆菌工程菌，突变酶比酶活提高5.2倍，催化活性提高3.8倍。本专利技术解决了L-乳酸脱氢酶催化活性低的限制性问题，为L-乳酸脱氢酶分子改造提供了一条新的思路。附图说明：图1为重组乳酸脱氢酶LcLDHQ88R的SDS-PAGE图。具体实施方式为了能够更清楚地理解本专利技术的
技术实现思路
，特举以下实施例详细说明，其目的仅在于更好理解本专利技术的内容而非限制本专利技术的保护范围。L-乳酸脱氢酶酶活测定方法：总反应体系包括50mmol/L乙酸钠缓冲液(pH5.5)，0.2mmol/LNADH，5mmol/LPPA，对照组中不含NADH，其他成分相同。混匀后于35℃保温5min，加入适量的酶液。检测NADH在340nm处吸收值的变化。酶活性单位(U)定义为：在上述条件下，每分钟催化氧化1μmolNADH所需要的酶量。比活性定义为每毫克酶蛋白所含的酶活单位数(U/mg)。实施例1：突变酶基因及其表达质粒的构建将扩增得到的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的基因Lcldh，扩增产物与pUCm-T连接，转化E.coliJM109，经蓝白斑筛选、菌液PCR验证和DNA测序。将测序正确的重组质粒命名为pUCm-T-Lcldh。用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切pUCm-T-Lcldh，回收Lcldh，与经同样双酶切的pET-28a(+)连接，获重组质粒pET-28a(+)-Lcldh。以pET-28a(+)-Lcldh重组质粒为模板，以F1primer(序列如SEQIDNO.5所示)、R1primer(序列如SEQIDNO.6所示)为引物，通过PCR进行定点突变，得到携带编码突变体基因的重组质粒，命名为pET-22b(+)-LcldhQ88R。实施例2：产L-乳酸脱氢酶大肠杆菌工程菌构建将实施例1得到的重组质粒pET-22b(+)-LcldhQ88R转化E.coliBL21感受态细胞，具体方法如下：1)接种LB平板活化的E.coliBL21于2mLLB培养基中，37℃，220r/min过夜培养；2％接种上述培养液于5mLLB培养基中，37℃，220r/min培养4h；2)取上述菌液1.4mL放入1.5mLEP管中，冰浴10min，4000r/min离心2min，收集菌体；3)加入1mL预冷的0.1MCaCl2溶液重悬上述细胞，冰浴10min，4000r/min，离心2min，收集菌体；4)加入100μL预冷的0.1MCaCl2溶液悬浮上述细胞，4℃保存30min即可转化；5)取100μL感受态细胞于冰上完全解冻后，轻轻将细胞均匀悬浮，加入5μL连接液，轻轻混匀，冰上放置30min；6)42℃水浴热激90s，冰浴15-20min；7)加入400μLLB培养基，37℃，220r/min振荡培养1h；8)室温下4000r/min离心5min，去掉450μL上清液，将剩余菌液吹打混匀后，涂布于Kan板上；8)挑取上述平板中白色菌落，进行菌液PCR验证，验证正确的重组菌送至测序公司测序，命名测序正确的重组菌为LcLdhBL21。实施例3：重组大肠杆菌诱导表达将实施例2构建的重组菌LcLdhBL21在LB平板上活化，挑取本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种催化活性提高的L‑乳酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示的序列。

【技术特征摘要】
1.一种催化活性提高的L-乳酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列是SEQIDNO.1所示的序列。2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体是在序列如SEQIDNO.2所示的氨基酸的基础上，将第88位的谷氨酰胺突变成了精氨酸。3.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体的核苷酸序列是SEQIDNO.3所示的序列。4.一种含有权利要求1所述突变体的重组表达载体。5.一种表达权利要求1所述L-乳酸脱氢酶突变体的基因工程菌。6.一种权利要求5所述基因工程菌的制备方法，其特征在于，是以携带编码L-乳酸脱氢酶基因的重组质粒为模板，设计并合成引物，通过PCR进行定点突变，将突变质粒连接到表达载体上，得到携带编码突变体基因的重组质粒，将重组质粒转化到大肠杆菌宿主菌中即得到重组大肠杆菌基因工程菌。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述表达载体是以下任意一种：pET-...

【专利技术属性】
技术研发人员：邬敏辰，刘艳，张婷，李雪晴，袁风娇，李剑芳，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32