一种芍药离体再生体系建立方法技术

本发明专利技术公开一种芍药离体再生体系建立方法，其特征在于，包括如下步骤：外植体获得‑愈伤组织制备‑不定芽分化‑继代增殖‑根诱导‑炼苗‑移栽，本申请系统地建立芍药品种杭白芍的离体再生快繁体系，为解决芍药种苗短缺的重要途径之一，对芍药南移和芍药的开发和推广利用都具有非常重要的意义，具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种芍药离体再生体系建立方法
本专利技术涉及芍药组织培养的繁殖方法，属于草本观赏植物种苗繁殖的
，具体涉及一种芍药离体再生体系建立方法。
技术介绍
芍药（学名：PaeonialactifloraPall.），别名别离草、花中宰相，属五桠果目，芍药科芍药属芍药组多年生草本。块根由根颈下方生出，肉质，粗壮，呈纺锤形或长柱形，粗0.6～3.5cm。芍药花瓣呈倒卵形，花盘为浅杯状，花期5～6月，花一般着生于茎的顶端或近顶端叶腋处，原种花白色，花瓣5～13枚。园艺品种花色丰富，有白、粉、红、紫、黄、绿、黑和复色等，花径10～30厘米，花瓣可达上百枚。果实呈纺锤形，种子呈圆形、长圆形或尖圆形。芍药喜光照，耐旱。芍药植株在一年当中，随着气候节律的变化而产生的阶段性发育变化主要表现为生长期和休眠期的交替变化。其中以休眠期的春化阶段和生长期的光照阶段最为关健。芍药的春化阶段，要求在0℃低温下，经过40天左右才能完成．然后混合芽方可萌动生长．芍药属长日照植物，花芽要在长日照下发育开花，混合芽萌发后，若光照时间不足，或在短日照条件下通常只长叶不开花或开花异常。芍药分布于我国东北、华北、陕西及甘肃南部等地区，在我国经济高度发达、生活水平相对较高、精神文化需求很大的江南地区，历来不是芍药栽培和园林应用的中心，至今能够被推广引用的品种非常稀少，存在着严重的热害、涝害、开花不良、病虫害严重和地下块根退化等问题，还存在花期短，长势逐年变弱的问题。芍药目前在杭州的集中种植点仅有花港观鱼公园巧药圃、西溪湿地公园绿堤等，所使用的品种、手法、地点和形成特色景观的数量均远不及牡丹，造成该现状的原因也主要是由于江南冬季温度较高导致冷量积累不足从而影响萌发与开花，春季温度较高导致花茎徒长、垂头和花期过短，以及及夏季酷热潮湿引发严重日灼、热害和孽生病虫害等。‘杭白芍’开花较早，花开很多，花粉量大，自然低温下‘杭白芍’打破芽休眠的最低需冷量为540CH和665CU，能够保证较快的萌芽率、较多茎数和单株平均开花数；芽休眠解除的最佳需冷量为795ＣＨ和906ＣＵ，可从更快巧破芽的休贱，保证枝繁叶茂、开花繁盛。在人工低温处理下的需冷量为672ＣＨ结合自然和人工化温的处理，打破‘杭白芍’芽休暇、保证顺利生长和开花的需冷量为672－795ＣＨ，是生长适应性较好的品种，值得在杭州等江南地区固林中推广使用，或优先用作培育优秀江南品科的亲本。杭白芍虽然需求量巨大，如何快速、高效地将其进行扩繁，是摆在种植者面前急需解决的技术问题。当前芍药最常用的繁殖方法是分株繁殖与播种繁殖，前者虽然能保持原品种的性状，但需要植株生长3～5年才能分一次，并且周期较长、繁殖系数较低，分株后的母株观赏价值明显下降；后者既不能保持原品种的性状，又需要经过4～5的童期才能开花，因此，两者均不适宜进行大规模的商业化生产。植物组织培养是植物快速繁殖的一种最为有效的方法，与传统繁殖方法相比，组织培养既能保持原有品种和优良性状，扩大其繁殖系数，又不受季节的影响，可以周年运转，大幅度地提高了繁殖的效率。CN102428872公开了一种通过种胚培养获得完整芍药植株的方法，但由于种胚并不能完全保持母本的性状，因此不能用于优良品种的扩繁。吴红娟等人发表的论文：观赏芍药‘大富贵’丛生芽诱导及生根技术、‘芍药不同品种启动培养比较及‘朱砂判’丛生芽诱导的研究’报道了以地下休眠芽为外植体诱导丛生芽的方法，该方法对于优良品种的扩繁存在以下不足：①一个植株所包含的地下休眠芽数量有限，以其为外植体的繁殖效率不高；②每株组培苗只能产生3～5个丛生芽，繁殖系数不高；③整个过程必须经历一个地下芽启动培养的过程，耗费大量的人力、物力，提高成本。胡映泉等人发表的论文‘芍药不定芽的诱导技术’(胡映泉,冯海华,时宝凌.芍药不定芽的诱导技术,山西林业科技,2003,增刊:23-24,33.)对芍药嫩茎进行组织培养，在MS+BA3.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L培养基上可一步成芽，缩短了成芽时间，但该论文数据较为含糊，统计的时间也未作交代，最终芽的诱导率最高只有74％。孙晓梅等人发表的论文‘芍药愈伤组织诱导及不定芽分化的研究’(孙晓梅,程婉,刘萍,周文强,王丹,杨宏光.芍药愈伤组织诱导及不定芽分化的研究.沈阳农业大学学报,2014-02,45(1):24-27.)对芍药子叶、茎、叶片进行培养，以基部茎为最优的不定芽分化外植体，但分化率只有35％，且需经过愈伤诱导阶段。综上所述，在芍药组织培养过程中，现有技术均成功分化出不定芽，但是他们多以种胚、地下休眠芽、茎段等为外植体，不仅分化率低，而且继代次数多，实验过程繁琐，周期较长，并不能获得理想的效果。综上，建立芍药品种杭白芍的离体再生快繁体系，为解决芍药种苗短缺的重要途径之一，对芍药南移和芍药的开发和推广利用都具有非常重要的意义。
技术实现思路
本专利技术主要解决的技术问题是公开了一种芍药离体再生体系建立方法。为了达到上述目的，本采用如下的技术方案：（1）外植体的获得：3月下旬至4月初选取幼嫩的杭白芍叶片，用清水冲洗干净，然后用安利洗涤剂漂洗一次，摇床上振荡15-20min；流水冲洗3min后，于无菌操作台上用75％乙醇消毒10-20s，立即倒入0.1％的升汞，最后用无菌水洗涤2次，将消毒完毕的叶片切割为2cm长的小段。（2）愈伤组织制备：取步骤（1）中处理得到的外植体小段，接种于诱导培养基中进行愈伤组织的诱导，培养温度为24-28℃，首先暗培养7-10d，然后进行光照培养25d；所述光照培养条件为：光照时间为14h/d，光照强度为1500lx；所述诱导培养基为MS+蔗糖30g/L+KT1mg/L+IBA0.02mg/L，pH值为5.4-6.0；（3）不定芽分化：将步骤（2）中诱导得到的愈伤组织，在外植体上切下，接入分化培养基进行不定芽分化，培养温度为24-28℃；光照时间14h/d，光照强度2500lx；所述分化培养基为1/2MS+NAA0.6mg/L+CPPU0.3mg/L，pH值为5.4-6.0；（4）继代培养：将诱导得到的不定芽切割后，每芽带0.3cm左右茎段和2-3片叶片，接入继代增殖培养基中进行继代培养25d，培养温度为24-28℃，光照时间为14h/d，光照强度为2500lx；所述继代增殖培养基为1/2MS＋NAA0.5mg/L，pH值为5.4-6.0；（5）根的诱导：将步骤（4）中继代增殖得到的试管苗接入生根培养基中进行生根培养，培养温度为24-28℃，光照时间为14h/d，光照强度为2000lx；所述生根培养基为1/2MS+2.0mg/LIBA，pH值为5.4-6.0；待不定根长满瓶底，植株整体生长稳健时，可准备移苗出瓶。(6)将培养瓶的瓶盖打开，炼苗2-3天，将根浸泡在生根制剂中，15min。所述生根制剂为微生物促生根剂，其组成包括：淡紫灰链霉菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、萘乙酸钠、活性炭、蔗糖；所述淡紫灰链霉菌(Streptomyceslavendulae)为CGMCCNO.2130；所述解淀粉芽孢杆菌为（Bacillusamyloliquefaciens）ATCC23843；所述短小芽孢杆菌为（Bacilluspumilus）ATCC7061；所述生本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种芍药离体再生体系建立方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：外植体获得‑愈伤组织制备‑不定芽分化‑继代增殖‑根诱导‑炼苗‑移栽。

【技术特征摘要】
1.一种芍药离体再生体系建立方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：外植体获得-愈伤组织制备-不定芽分化-继代增殖-根诱导-炼苗-移栽。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：（1）外植体的获得：3月下旬至4月初选取幼嫩的芍药叶片，用清水冲洗干净，然后用洗涤剂漂洗一次，摇床上振荡15-20min；流水冲洗3min后，于无菌操作台上用75％乙醇消毒10-20s，立即倒入0.1％的升汞，最后用无菌水洗涤2次，将消毒完毕的叶片切割为2cm长的小段；（2）愈伤组织制备：取步骤（1）中处理得到的外植体小段，接种于诱导培养基中进行愈伤组织的诱导，首先暗培养7-10d，然后进行光照培养25d；所述光照培养条件为：光照时间为14h/d，光照强度为1500lx；所述诱导培养基为MS+蔗糖30g/L+KT1mg/L+IBA0.02mg/L；（3）不定芽分化：将步骤（2）中诱导得到的愈伤组织，在外植体上切下，接入分化培养基进行不定芽分化，光照时间14h/d，光照强度2500lx；所述分化培养基为1/2MS+NAA0.6mg/L+CPPU0.3mg/L；（4）继代培养：将诱导得到的不定芽切割后，接入含有继代增殖培养基的试管中进行继代培养25d，所述继代增殖培养基为1/2MS＋NAA0.5mg/L；（5）根诱导：将步骤（4）中继代增殖得到的试管苗接入含有生根培养基的瓶中进行生根培养，所述生根培养基为1...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋建华，周小成，许奇华，吴仁洲，程爱群，
申请(专利权)人：蒋建华，
类型：发明
国别省市：浙江,33