【技术实现步骤摘要】
用于空间上测量纳米级结构的方法和设备
本专利技术涉及一种空间上测量样品中的至少一个纳米级结构的方法并且涉及一种用于实施这种方法的设备。特别地,所述方法包括步骤:用荧光标记在不同位置处标记至少一个纳米级结构;利用激发光激发荧光标记从而发射荧光;记录从样品发射出的荧光;以及从记录的荧光的强度确定各个荧光标记在样品中的位置。更特别地,本专利技术涉及一种方法,其中,确定各个荧光标记在样品中的位置以超过激发光的波长和荧光的波长下的衍射极限的精度执行。
技术介绍
已知一种被称为MINFLUX显微术的空间上测量样品中的至少一个纳米级结构的方法,其中,以超过激发光的波长和荧光的波长下的衍射极限的精度确定样品中的各个的荧光标记的位置,见BalzarottiF,EilersY,GwoschKC,AH,WestphalV,StefaniFD,ElfJ,HellSW的Nanometerresolutionimagingandtrackingoffluorescentmoleculeswithminimalphotonfluxes(《纳米分辨率成像和光子通量最小的荧光分子追踪》),Science355,2016年12月22日在线发布。在MINFLUX显微术中,通过以下方式确定各个荧光标记的位置:将激发光的强度分布的零点布置在各个荧光标记的估计位置周围的测量区域的中心处以及在测量区域的边界处围绕中心均匀分布的三个位置处。在该总共四个零点位置处,单独地测量来自相应的荧光标记的荧光的强度,并且从对于零点的不同位置分别记录的各个荧光标记的荧光的强度来确定各个荧光标记的位置。零点的四个位置布 ...
【技术保护点】
1.一种空间上测量样品(13)中的多个纳米级结构的方法,所述方法包括步骤:‑利用荧光标记(8、9)在不同位置处标记(1)各个结构;‑利用激发光(25)激发荧光标记(8、9)从而发射荧光(42),其中,‑激发光(25)的强度分布(24)‑或者对通过荧光标记(8、9)发射荧光具有影响的另外的光的强度分布(48)包括局部的最小值(26),所述最小值布置在样品(13)中的不同位置处;‑既针对各个荧光标记(8、9)也针对最小值(26)的不同位置(20、21、22、23)单独地记录样品(13)发射出的荧光(42);以及‑从针对相应的荧光标记(8、9)针对最小值(26)的不同位置(20、21、22、23)记录的荧光(42)的强度,确定(5)各个荧光标记(8、9)在样品(13)中的位置,‑其中,所述方法包括将各个结构(7)耦接(2)到各个定位辅助件(12)的另外的步骤,所述定位辅助件在样品(13)中的位置是‑已知的,或者‑在耦接(2)的步骤之后从由定位辅助件(12)反射的光确定,以及‑其中,激发的步骤包括将局部的最小值(26)在不同位置(20、21、22、23)处布置(3)在近距离范围(18)中,所述 ...
【技术特征摘要】
2017.03.07 DE 102017104736.0;2017.07.20 EP 17182451.一种空间上测量样品(13)中的多个纳米级结构的方法,所述方法包括步骤:-利用荧光标记(8、9)在不同位置处标记(1)各个结构;-利用激发光(25)激发荧光标记(8、9)从而发射荧光(42),其中,-激发光(25)的强度分布(24)-或者对通过荧光标记(8、9)发射荧光具有影响的另外的光的强度分布(48)包括局部的最小值(26),所述最小值布置在样品(13)中的不同位置处;-既针对各个荧光标记(8、9)也针对最小值(26)的不同位置(20、21、22、23)单独地记录样品(13)发射出的荧光(42);以及-从针对相应的荧光标记(8、9)针对最小值(26)的不同位置(20、21、22、23)记录的荧光(42)的强度,确定(5)各个荧光标记(8、9)在样品(13)中的位置,-其中,所述方法包括将各个结构(7)耦接(2)到各个定位辅助件(12)的另外的步骤,所述定位辅助件在样品(13)中的位置是-已知的,或者-在耦接(2)的步骤之后从由定位辅助件(12)反射的光确定,以及-其中,激发的步骤包括将局部的最小值(26)在不同位置(20、21、22、23)处布置(3)在近距离范围(18)中,所述近距离范围围绕相应的定位辅助件(19)的位置,近距离范围(18)的尺寸不大于激发光(25)的波长和荧光(42)的波长下的衍射极限。2.根据权利要求1所述的方法,其中,近距离范围(18)的尺寸不大于激发光(25)的波长和荧光(42)的波长下的衍射极限的一半或四分之一。3.根据权利要求1或2所述的方法,其中,从荧光(42)的强度确定各个荧光标记(8、9)的位置,针对最小值(26)的不超过4n、不超过3n或者不超过2n个不同位置(20、21、22、23)记录所述荧光(42)的强度,其中,n是下述空间方向的数量,在所述空间方向上确定各个荧光标记(8、9)在样品(13)中的位置。4.根据权利要求3所述的方法,其中,确定(5)各个荧光标记(8、9)在样品(13)中的位置的步骤包括:将包括局部极值的空间函数拟合到针对相应的荧光标记(8、9)针对最小值(26)的不同位置(20、21、22、23)记录的荧光的强度。5.根据权利要求4所述的方法,其中,通过利用最小值(26)扫描:-反射光的所述定位辅助件(12)中的至少一个、-荧光标记(8、9)中的至少一个、或-另外的荧光标记,以及在扫描时利用时间分辨率记录(4)从样品(13)反射出的光或者从样品(13)发射出的荧光(42),确定包括局部极值的所述空间函数。6.根据权利要求1或2所述的方法,其中,从以下中选择在不同位置处标记各个结构(7)的荧光标记(8、9):-在从荧光标记(8、9)的激发光谱和发射光谱中选择的光谱特性方面不相同的荧光标记(8、9);以及-具有活跃状态和非活跃状态并且能够利用切换光在荧光标记的活跃和非活跃状态之间转换的荧光标记(8、9),在活跃状态下,荧光标记能够被激发光(25)激发从而发射荧光(42),在非活跃状态下,至少利用相同的激发光(25),荧光标记不能被激发来发射荧光(42)。7.根据权利要求1或2所述的方法,其中,相对于用于将最小值(26)定位在近距离范围(18)内的方式而言,通过另外的用于使最小值(26)相对于样品(13)相对运动的方式,使最小值(26)接近定位辅助件(19)的位置。8.根据权利要求7所述的方法,其中,定位辅助件(19)的位置相对于样品(13)的固定点(29)固定,相对于样品(13)的所述固定点(29)接近定位辅助件(19)的位置。9.根据权利要求1或2所述的方法,其中,定位辅助件(19)的位置布置成:-相距最小距离,所述最小距离不小于激发光(25)的波长和荧光(42)的波长下的衍射极限的两倍,以及-在样品(13)中呈从循环性图案、六边形图案和方形图案中选择的预定图案。10.根据权利要求1或2所述的方法,其中,样品(13)中的定位辅助件(12)是固定的耦接位点(11),结构(7)经由免疫反应被耦接到所述耦接位点(11)。11.根据权利要求1或2所述的方法,其中,定位辅助件(12)包括从金颗粒(14)、银颗粒和量子点中选择的光反射体。12.根据权利要求1或2所述的方法,其中,结构(7)包括等同的结构(7),所述等同的结构(7)在样品(13)的不同区域中经受不同的环境条件。13.根据权利要求1或2所述的方法,其中,针对不同的至少两个时间点从针对所述至少两个时间点记录的荧光(42)的强度确定各个荧光标记(8、9)在样品(13)中的位置,-结构(7)在所述至少两个时间点经受不同的环境条件,或者-所述至少两个时间点跟随在结构(7)经受的环境条件之后。14.一种用于空间上测量样品(13)中的多个纳米级结构的设备,其中,结构(7)中的每一个都耦接到定位辅助件(12),所述定位辅助件在样品(13)中的位置是已知的或者从定位辅助件(12)反射的光确定,所述设备包括:-用于样品(13)的样品保持器(34);-指向样品保持器(34)的物镜(36);-光源(37),该光源-或者将激发光(25)耦入物镜(36)中,使得由物镜(36)聚焦的激发光(25)的强度分布包括局部的最小值(26),-或者将激发光(25)和对通过荧光标记(8、9)发射荧光(42)具有影响的另外的光耦入物镜(36),使得由物镜(36)聚焦的所述另外的光的强度分布具有局部的最小值(26),-扫描仪(40),所述扫描仪配置为能够使最小值的位置(20、21、22、23)相对于样品保持器(34)移动;-检测器(45),所述检测器配置为能够针对最小值(26)的不同位置(20、21、22、23)单独地记录从样品(13)发射出的荧光(42);-评估单元(44),所述评估单元配置为能够从针对相应的荧光标记(8、9)针对最小值(26)的不同位置(20、21、22、23)记录的荧光(42)的强度,确定各个荧光标记(8、9)在样品(13)中的位置;以及-控制器,所述控制器配置为能够将局部的最小值(26)在不同位置(20、21、22、23)处布置在近距离范围(18)中,所述近距离范围(18)围绕相应的定位辅助件(19)的位置,近距离范围(18)的尺寸不大于激发光(25)的波长和荧光(42)的波长下的衍射极限。15.一种空间上测量...
【专利技术属性】
技术研发人员:S·W·黑尔,Y·艾勒斯,K·格沃施,F·巴尔扎罗蒂,
申请(专利权)人:马克斯普朗克科学促进学会,
类型:发明
国别省市:德国,DE
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