【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种确定物体中单一化的荧光团分子的分子位置的方法。更具体地，本专利技术涉及包括独立权利要求1的前序部分的特征的方法。 此外，本专利技术涉及一种用于确定物体中单一化荧光团分子的分子位置的激光扫描显微镜。更具体地，本专利技术涉及一种包括独立权利要求15的前序部分的特征的激光扫描显微镜。
技术介绍
1、us10,900,901b2公开了一种高空间分辨率确定样品中的n个空间维度中的单一化的分子的位置的方法，所述单一化的分子可用激发光激发以发射发光光。确定包括单一化的分子的初步局部区域。激发光以一强度分布引导到样品上，该强度分布具有零点和在n个空间方向中的每一个方向上的两侧邻接零点的强度增加区域。首先，将零点布置在初步局部区域的已知侧上的初步位置处。然后，根据针对零点的当前位置准同时分开配准的发光光的光子，通过将零点在零点的当前位置之间重复移位而将零点的当前位置在n个空间维度中的每一个空间维度中接连移位到初步局部区域中。一旦在零点的当前位置处配准了发光光的m个光子，每个零点的位置就被移位。m可以非常小并且小到1。当接连移位零点的位置时，激发光的最大强度可以被成功地增加。随着零点的位置的成功移位，它们与样品中分子的实际位置的距离减小。通过增加激发光的最大强度，减小的距离在来自单一化的分子的不同强度的发光光的较高带宽之上重新分布。在开始确定单一化的分子的位置时，可以用高斯强度分布的激发光，即用激发光的简单聚焦光束，在空间维度中的每一个维度中沿着圆形或螺旋形轨道扫描包括单一化的分子的样品的较大区域。然后，根据轨道之上的发光光的强度
2、wo 2020/064108 a1公开了一种用于在物镜的聚焦区域中形成和移位光强度分布的方法和设备。相干输入光的多个离散部分被引导到物镜的光瞳的多个不同光瞳区域中。物镜的聚焦区域中的光强度分布被形成为显示由强度最大值包围的局部强度最小值。相干输入光的多个部分中的至少两个离散部分关于它们的相位和它们的振幅中的至少一个借助于单独的电光调制器被分开调制，以便沿着围绕物镜的光轴的圆移动局部强度最小值。检测由位于聚焦区域中的单个荧光团分子发射的光子。对于探测到的每个光子，配准聚焦区域中的局部强度最小值的相关联位置。计算配准的位置的平均位置，并将其作为聚焦区域中单个荧光团分子的位置。
3、m.weber等人： “minsted fluorescence localization and nanoscopyminsted”，nat.phot.， 2021，https://doi.org/10.1038/s41566-021-00774-2公开了一种基于受激发射损耗(sted：stimulated-emission-depletion)的荧光定位和超分辨率显微镜概念，其提供了低至分子尺度的空间精度和分辨率。sted环(donut)的强度最小值以及因此最小sted的点充当用于荧光团在侧向平面中定位的可移动参考坐标。共对准的激发光束和sted光束以125khz的旋转频率围绕荧光团分子的估计位置在一半径处盘旋。在每次光子检测之后更新估计位置和半径。所述半径从所使用的sted显微镜的有效点扩散函数(e-psf)的受衍射限制的直径的一半开始。在检测到每个光子之后，估计位置被移位，并且半径按半径的一部分减小。此外，sted强度被增加以减小e-psf的直径。因此，尽管e-psf的最大强度逐渐更高且斜率逐渐变陡，但荧光团分子始终经历适度的sted强度。通过放大荧光团，确定荧光团分子位置时的精度增加。虽然minsted具有高精度潜力，但实际实现的精度可能会受到热问题的影响，这是由于高强度的sted光反复射向非常小的局部区域。据报道，脉冲激发光具有635nm的波长，并且脉冲sted光也具有775nm的sted波长。对于具有最大峰强度在大约660nm处的荧光光发射峰的atto 647n荧光团分子，sted波长处于发射峰的远红边缘处，其中剩余峰强度为最大峰强度的大约10％。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种方法和一种激光扫描显微镜，用于以较高的精度和最少的由荧光团分子发射的光子来确定物体中单一化的荧光团分子的分子位置，使得对荧光团分子的光化学应力和/或对包括该分子的物体的光热应力最小化。
2、本专利技术的目的通过相应地包括独立权利要求1、5和10的特征的方法以及通过包括权利要求24的特征的激光扫描显微镜来实现。
3、所述方法的优选实施例在从属权利要求中限定。
4、本专利技术涉及一种确定物体中单一化的荧光团分子的分子位置的方法。
5、单一化的荧光团分子在空间上与其它荧光团分子分开，所述其它荧光团分子可被相同的激发光激发以用于发射不可区分的荧光光。例如由于物体中的荧光团分子的低浓度，待确定分子位置的荧光团分子可以自然地被单一化。替代性地，可以通过调暗或暂时关闭相邻荧光团分子，或通过仅打开单个荧光团分子而使相邻荧光团分子处于暗状态，来主动地将荧光团分子单一化。单一化荧光团分子并检查测量体积中是否确实仅存在一个单一化的分子的方法是本领域技术人员已知的。在本专利技术的一些实施例仅涉及激发光的情况下，单一化的荧光团分子到相邻荧光团分子的合适的最小距离与激发光的波长在同一数量级。在附加性地涉及荧光抑制光的本专利技术的其它实施例中，小得多的距离可能仍然是合适的。通常，单一化的荧光团分子到相邻荧光团分子的合适距离应确保这些相邻荧光团分子不被激发而发射不能与由待确定位置的单一化的荧光团分子发射的荧光光分开配准的荧光光。
6、根据本专利技术的方法包括提供包括荧光激发光和荧光影响光的光束的步骤。所述荧光影响光可以与所述荧光激发光相同，或者所述荧光影响光可以是除了所述荧光激发光之外附加性施加的荧光抑制光。附加的荧光抑制光可以例如是sted(受激发射损耗)光，其通过在激发的荧光团分子能够自发发射荧光光之前将荧光团分子从激发态返回到其基态来影响荧光团分子的荧光，其中荧光团分子已经被激发光激发到激发态。
7、根据本专利技术的方法还包括对光束进行整形和聚焦而形成具有荧光影响光的中心强度最小值的光强度分布的步骤。更进一步地，根据本专利技术的方法包括相对于所述物体连续移位所述光强度分布而使得所述中心强度最小值沿着围绕所述单一化的荧光团分子的估计位置重复延伸的轨道连续移动的步骤。所述轨道围绕所述估计位置重复延伸的特征可以通过所述轨道包围或环绕所述估计位置来实施。然而，不需要所述轨道以固定距离围绕所述估计位置延伸。特别地，所述轨道可以有目的地暂时非常接近或甚至穿过所述估计位置。然而，由所述轨道跨越或围出的整个区域将在将要在其中确定所述单一化的荧光团分子的分子位置的所有空间维度中围绕所述估计位置延伸。
8、根据本专利技术的方法还包括以下步骤：单独配准由于所述荧光激发光的激发而由所述单一化的荧光团分子发射的荧光光的多个单独的光子，以及针对所配准的多个单独的光子中的每个单独的光子的激发记录所述中心强度最小值的强度最小值位置。因此，从所配准的每个单独的光子中提取出尽可能多的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种确定物体(11)中的单一化的荧光团分子的分子位置的方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述STED波长设置到或接连减小到一波长，在此波长下，所述单一化的荧光团分子的荧光光发射峰仍具有其最大峰强度的至少30％、优选地至少35％。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在配准所述多个单独的光子之前，对所述荧光光(40)进行陷波滤波或边缘滤波以抑制STED波长的光；和/或以脉冲形式施加所述STED光，并且对配准所述多个单独的光子进行选通以选择在所述STED光的相应脉冲之后发射的光子。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，通过以下方式来增加所述荧光影响光的荧光影响有效性：
5.一种确定物体(11)中的单一化的荧光团分子的分子位置的方法，所述方法包括：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述荧光影响光的和所述荧光激发光(4)的强度保持恒定。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述荧光影响光是荧光抑制光(5)，特别是STED光，其中，所述荧
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，对配准所述荧光光(40)的光子进行选通，以选择在相应的荧光影响光脉冲之后发射的光子，并且阻挡来自尚未经历相应的完整荧光影响光脉冲的荧光团分子的光子。
9.根据权利要求5至8中任一项所述的方法，其特征在于，所述轨道(31)在所有三个空间维度中围绕所述单一化的荧光团分子的估计位置(34)延伸。
10.一种确定物体(11)中的单一化的荧光团分子的分子位置的方法，所述方法包括：
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，通过以下方式来增加所述荧光影响光的荧光影响有效性：
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，通过以下方式来基于所记录的强度最小值位置更新所述轨道延伸所围绕的估计位置：
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，围绕所述估计位置(34)的轨道(31)的延伸尺度按一延伸尺度分数减少，所述延伸尺度分数在1％至10％范围内、并且优选地在2％至5％范围内，其中，增加所述荧光影响光的荧光影响有效性而使得所述光强度分布的有效激发点扩散函数的延伸尺度相应地减少，优选地也按所述延伸尺度分数减少。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，除非已经达到预先确定的最小延伸尺度，否则减少围绕所述估计位置(34)的轨道(31)的延伸尺度，和/或除非已经达到预先确定的最大荧光影响有效性，否则增加所述荧光影响光的荧光影响有效性。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，尽管所述估计位置(34)更新以及所述轨道(31)的延伸尺度减少和/或所述荧光影响光的荧光影响有效性增加，但是所述中心强度最小值(39)沿着所述轨道(31)的运动在所配准的单独的光子之上继续。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述轨道(31)围绕所述单一化的荧光团分子的估计位置(34)延伸的重复率是配准所述单独的光子的光子速率的至少50％，并且优选至少100％。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，以所述轨道(31)围绕所述单一化的荧光团分子的估计位置(34)延伸的重复率的至少10倍、优选地至少100倍的采样率对指示所配准的单独的光子的信号进行采样。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述轨道(31)在所有三个空间维度中围绕所述单一化的荧光团分子的估计位置(34)延伸，其中，所述轨道(31)在所述三个空间维度中围绕估计位置(34)的延伸尺度优选地反映了所述光强度分布(39)的有效激发点扩散函数(41)在三个空间维度中的延伸尺度。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，在对所述多个单独的光子中的两个连续的单独的光子的相应响应之间，所述轨道(31)在椭球的表面上运行，所述椭球具有在所述光束被聚焦到之中的焦平面中的x半轴和y半轴以及在所述光束(3)沿之聚焦到所述焦平面的z方向上的z半轴，其中，所述轨道(31)优选地以xy旋转频率围绕z方向旋转，所述xy旋转频率不高于z旋转频率，所述轨道(31)以所述z旋转频率围绕在所述焦平面中旋转的轴线旋转。
20.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，在对所述多个单独的光子中的两个连续的单独的光子的相应响应之间，所述轨道(31)沿着Lissajous曲线延伸，其中，所述Lissajous曲线优选地...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种确定物体(11)中的单一化的荧光团分子的分子位置的方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述sted波长设置到或接连减小到一波长，在此波长下，所述单一化的荧光团分子的荧光光发射峰仍具有其最大峰强度的至少30％、优选地至少35％。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在配准所述多个单独的光子之前，对所述荧光光(40)进行陷波滤波或边缘滤波以抑制sted波长的光；和/或以脉冲形式施加所述sted光，并且对配准所述多个单独的光子进行选通以选择在所述sted光的相应脉冲之后发射的光子。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，通过以下方式来增加所述荧光影响光的荧光影响有效性：
5.一种确定物体(11)中的单一化的荧光团分子的分子位置的方法，所述方法包括：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述荧光影响光的和所述荧光激发光(4)的强度保持恒定。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述荧光影响光是荧光抑制光(5)，特别是sted光，其中，所述荧光影响光脉冲不长于所述荧光团分子的荧光寿命但长于激发光脉冲。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，对配准所述荧光光(40)的光子进行选通，以选择在相应的荧光影响光脉冲之后发射的光子，并且阻挡来自尚未经历相应的完整荧光影响光脉冲的荧光团分子的光子。
9.根据权利要求5至8中任一项所述的方法，其特征在于，所述轨道(31)在所有三个空间维度中围绕所述单一化的荧光团分子的估计位置(34)延伸。
10.一种确定物体(11)中的单一化的荧光团分子的分子位置的方法，所述方法包括：
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，通过以下方式来增加所述荧光影响光的荧光影响有效性：
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，通过以下方式来基于所记录的强度最小值位置更新所述轨道延伸所围绕的估计位置：
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，围绕所述估计位置(34)的轨道(31)的延伸尺度按一延伸尺度分数减少，所述延伸尺度分数在1％至10％范围内、并且优选地在2％至5％范围内，其中，增加所述荧光影响光的荧光影响有效性而使得所述光强度分布的有效激发点扩散函数的延伸尺度相应地减少，优选地也按所述延伸尺度分数减少。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，除非已经达到预先确定的最小延伸尺度，否则减少围绕所述估计位置(34)的轨道(31)的延伸尺度，和/或除非已经达到预先确定的最大荧光影响有效性，否则增加所述荧光...
【专利技术属性】
技术研发人员：M·洛伊特内格尔，M·韦伯，H·冯德埃姆德，S·W·黑尔，
申请(专利权)人：马克斯普朗克科学促进学会，
类型：发明
国别省市：
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