MDBK驯化悬浮方法和二阶病毒生产工艺技术

本发明专利技术涉及MDBK细胞驯化悬浮方法和二阶病毒生产工艺。具体而言，本发明专利技术涉及驯化贴壁MDBK细胞使其适应无血清悬浮培养，并以其作为宿主细胞，采用二阶培养接毒方式生产能在悬浮MDBK细胞上病变或有敏感性的病毒，即，细胞长至2.0～20.0×106细胞/mL时，用生产培养基稀释1～5倍，使密度在1.0～10.0×106细胞/mL之间，然后接毒，或在稀释之前接毒。本发明专利技术的悬浮MDBK细胞适应在无血清和化学成分确定的培养基中悬浮生长，其二阶病毒生产工艺简单，易放大；不换液，培养基利用效率高；生产和生长培养基可相同或不同，二者按照比例混合，即可使细胞二次生长并促进病毒表达。

【技术实现步骤摘要】
MDBK驯化悬浮方法和二阶病毒生产工艺
本专利技术涉及MDBK细胞驯化悬浮方法和悬浮MDBK细胞相关疫苗生产领域，本专利技术MDBK驯化悬浮方法和二阶病毒生产工艺两者在技术方案中可以同时存在也可以独立存在。具体涉及30L以上的生物反应器培养悬浮MDBK细胞、以二阶培养方法培养悬浮MDBK细胞以生产疫苗的工艺技术。
技术介绍
哺乳动物细胞大规模培养技术是生物制药企业下游通用技术之一，其在该行业发挥极为重要的作用。该项技术的关键在于实现哺乳动物细胞的悬浮无血清大规模培养，从而提高产能，降低成本，并易于放大。贴壁细胞培养时的通常做法是在培养基中添加一定量血清使细胞贴壁生长，而血清化学成分不确定，且质量不稳定，有批间差，用此种细胞生产的生物制品，质量难以控制，很难通过食品药品监督管理局的审批，而悬浮无血清培养相对常见的贴壁培养来说，单位体积能生长更多的细胞，从而能生产更多的生物制品。MDBK细胞是从一只表观正常的成年牛肾脏建立的MDBK细胞株，中文名为牛肾细胞，该细胞是贴壁依赖性的肾上皮细胞。它能支持多种病毒的增殖，包括病毒性牛腹泻疫苗、牛传染性鼻气管炎疫苗等病毒。现有的MDBK细胞驯化悬浮的缺陷在于：1、有的无法实现完全无血清培养；2、一般采用两步走的方法，即先降为无血清再悬浮培养，由于贴壁培养采用的培养基通常为基础培养基加血清，基础培养基营养成分较弱，驯化过程中贴壁培养表面积/体积比通常较小，限制了营养的摄入，整个驯化过程耗时长；3、基因修饰后驯化，即通过基因改造，为贴壁细胞株插入不利于贴壁的基因片段，改变原有的贴壁培养方式，使细胞悬浮生长，然后再通过培养基的不断优化与改变使细胞能够无血清高密度生长，此种办法容易实现，但是插入了外源基因片段，影响产品的质量。因此，需要对MDBK细胞的悬浮驯化和无血清驯化方法进一步研究，并克服以上三方面的缺陷。在病毒接毒工艺方面，传统的病毒性疫苗生产工艺是指细胞生长到一定的密度后，换液再接毒或者直接接毒。截至目前，并未有关于悬浮MDBK细胞的二阶培养方法的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的第一方面涉及一种悬浮MDBK细胞疫苗生产的二阶培养方法，其包含如下步骤：1)细胞生长：悬浮MDBK细胞在生长培养基中生长至2.0×106细胞/mL～20.0×106细胞/mL；2)接毒：接毒量在10-1～10-5MOI之间，或者在步骤3)之后按照此接毒量接毒；3)稀释/补加生产培养基：用生产培养基稀释1～5倍，稀释后细胞密度到1.0×106细胞/mL～10.0×106细胞/mL；4)二次生长：细胞二次生长；5)任选地，收获病毒液纯化制苗。在一些实施方案中，悬浮MDBK细胞生长为悬浮罐培养，培养工作体积为30L及以上。在一些实施方案中，步骤1)中细胞密度在5.0×106细胞/mL～16.0×106细胞/mL，优选地，6.0×106细胞/mL～15.0×106细胞/mL，最优选地，10.0×106细胞/mL。在一些实施方案中，步骤2)中细胞接毒量在10-1～10-4MOI之间，更优接地，10-1～10-3MOI，最优接地，10-2MOI。在一些实施方案中，步骤3)中悬浮MDBK细胞生产培养基稀释为1～4倍，更优选地，1～3倍稀释，最优选为2倍稀释。在一些实施方案中，步骤3)中接毒后细胞密度在1.0×106细胞/mL～10.0×106细胞/mL，优选地，4.0×106细胞/mL～10.0×106细胞/mL。在一些实施方案中，悬浮MDBK细胞为疫苗生产所用的悬浮细胞，或是由贴壁MDBK细胞驯化而来、能够悬浮生长生产的悬浮MDBK细胞，优选地，悬浮MDBK细胞是由贴壁MDBK细胞经低血清驯化或无血清驯化而来，所述无血清驯化是指驯化后的MDBK细胞可在无血清存在的培养基中生长、增殖，和/或，优选地，悬浮MDBK细胞是由贴壁MDBK细胞经悬浮驯化而来。在一些实施方案中，病毒为在对应悬浮MDBK细胞上敏感、能够生产出对应疫苗的病毒，优选地，病毒选自病毒性牛腹泻疫苗或牛传染性鼻气管炎疫苗。在一些实施方案中，细胞生长温度在35℃～37℃，接毒后病毒生产温度在30℃～37℃。在一些实施方案中，细胞生长接种密度在0.3×106细胞/mL～1.0×106细胞/mL细胞，生长天数在2～8天达到最高细胞密度。换言之，本专利技术解决的一个技术问题是克服现有技术的不足，提供一种贴壁MDBK细胞的低血清、无血清驯化和悬浮驯化方法，使该细胞生长状态稳定、分散性好，适用于规模化培养，并有利于病毒的复制和表达。为此，本专利技术通过培养基的改变和培养方式的改变，使原有贴壁生长的细胞株能够低血清、无血清、悬浮高密度生长。其中，血清驯化包含：A：逐步降血清适应驯化方法，即，逐步降低细胞传代培养过程中培养基血清浓度，直至MDBK细胞适应低血清浓度下的培养条件；B：直接无血清驯化方法。用于低血清驯化的起始的处于最佳状态并稳定生长的MDBK细胞可以是从冻存的贴壁MDBK细胞复苏、恢复而来的MDBK细胞。具体而言，首先，A：逐步降血清适应驯化方法是将贴壁MDBK细胞低血清驯化，使得贴壁MDBK细胞在较低血清条件下(1％～3％)贴壁正常生长，再对适应低血清培养的贴壁细胞进行降血清至无血清悬浮生长；B：直接无血清驯化方法，系指将低血清培养基中培养的贴壁MDBK细胞直接置于无血清培养基中悬浮培养，筛选无血清培养基的同时让MDBK细胞适应悬浮培养，再开发出适用于悬浮MDBK细胞高密度悬浮培养的化学成分确定的无蛋白、无动物来源的无血清细胞培养基，如CDMDBK211(JSB-211)。例如，在MDBK细胞已完全适应贴壁低血清生长后，选择5～8种健顺生物CD系列无血清培养基进行无血清驯化和悬浮驯化，直到MDBK细胞完全适应悬浮培养方式，并且悬浮MDBK细胞能够开始稳定的传代生长，悬浮MDBK细胞密度能够达到2.0×106细胞/mL～4.0×106细胞/mL之间，活率维持在95％左右。本专利技术还优化了培养基中氨基酸、维生素、微量元素、生长因子、水解物等成分，获得优化的悬浮MDBK细胞无血清细胞培养基，使悬浮MDBK细胞能够更高密度稳定生长传代，悬浮MDBK细胞最高密度能够达到6.0×106细胞/mL～8.0×106细胞/mL之间，活率维持在98％左右。本专利技术还开发了悬浮MDBK细胞CD化学成分明确的无蛋白、无动物来源的无血清细胞培养基，其适用于悬浮MDBK细胞高密度全悬浮培养，悬浮MDBK细胞最高密度能够达到8.0×106细胞/mL～15.0.0×106细胞/mL之间，甚至20.0×106细胞/mL，活率维持在98％左右。本专利技术培养出的悬浮MDBK细胞生长状态稳定，分散性好且无较大团块、完全适应在无血清且化学成分确定的培养基中进行悬浮培养，并能够规模化生产，悬浮MDBK细胞密度能够达到8.0×106细胞/mL～20.0×106细胞/mL之间，活率维持在95％以上，甚至高达98％。本专利技术中的悬浮MDBK细胞为适应无血清悬浮培养的悬浮MDBK细胞，既可以是市售可得的悬浮MDBK细胞，也可以是如上所述由贴壁MDBK细胞经低血清、无血清驯化和/或悬浮驯化而获得的悬浮MDBK细胞。本专利技术中的DMEM(高葡萄糖)(JSB-66001)基础培养基，BD004(JSB-DP049)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种悬浮MDBK细胞疫苗生产的二阶培养方法，其包含如下步骤：1)细胞生长：悬浮MDBK细胞在生长培养基中生长至2.0×106细胞/mL～20.0×106细胞/mL；2)接毒：接毒量在10‑1～10‑5MOI之间，或者在步骤3)之后按照此接毒量接毒；3)稀释/补加生产培养基：用生产培养基稀释1～5倍，稀释后细胞密度到1.0×106细胞/mL～10.0×106细胞/mL；4)二次生长：细胞二次生长；5)任选地，收获病毒液纯化制苗。

【技术特征摘要】
1.一种悬浮MDBK细胞疫苗生产的二阶培养方法，其包含如下步骤：1)细胞生长：悬浮MDBK细胞在生长培养基中生长至2.0×106细胞/mL～20.0×106细胞/mL；2)接毒：接毒量在10-1～10-5MOI之间，或者在步骤3)之后按照此接毒量接毒；3)稀释/补加生产培养基：用生产培养基稀释1～5倍，稀释后细胞密度到1.0×106细胞/mL～10.0×106细胞/mL；4)二次生长：细胞二次生长；5)任选地，收获病毒液纯化制苗。2.根据权利要求1所述的悬浮MDBK细胞疫苗生产的二阶培养方法，其中悬浮MDBK细胞生长为悬浮罐培养，培养工作体积为30L及以上。3.根据权利要求1或2所述的悬浮MDBK细胞疫苗生产的二阶培养方法，其中步骤1)中细胞密度在5.0×106细胞/mL～16.0×106细胞/mL，优选地，6.0×106细胞/mL～15.0×106细胞/mL，最优选地，10.0×106细胞/mL。4.根据权利要求1至3任一项所述的悬浮MDBK细胞疫苗生产的二阶培养方法，其中步骤2)中细胞接毒量在10-1～10-4MOI之间，更优接地，10-1～10-3MOI，最优接地，10-2MOI。5.根据权利要求1至4任一项所述的悬浮MDBK细胞疫苗生产的二阶培养方法，其中步骤3)中悬浮MDBK细胞生产培养基稀释为1～4倍，更优选地，1～3倍稀释，最优选为...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡仕君，侯瑞娟，
申请(专利权)人：甘肃健顺生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：甘肃,62