具有增强的嗜热性和嗜碱性的木聚糖酶制造技术

本发明专利技术提供了一种木聚糖酶或者一种修饰的木聚糖酶，其包含至少一个选自第１１，１１６，１１８，１４４和１６１位氨基酸的位置上的取代的氨基酸残基，所述位置从所述修饰的木聚糖酶与里氏木霉（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　　ｒｅｅｓｅｉ）木聚糖酶Ⅱ氨基酸序列对比中确定。本发明专利技术所述木聚糖酶与相应的天然木聚糖酶相比呈现改良的嗜热性，嗜碱性，表达效率或其组合。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及木聚糖酶。更特别地，本专利技术涉及木聚糖酶及在高温和高pH条件下具有改良性能的修饰的木聚糖酶。
技术介绍
木聚糖酶是具有广泛商业用途的一组酶。木聚糖酶主要应用于造纸业中纸浆的生物漂白中。另外，木聚糖酶在果汁和葡萄酒中用作澄清剂，及在精密仪器和半导体的洗涤中用作酶制剂(例如美国专利No.5,078,802)，而且它们还用于改良家禽和猪饲料的消化性。在造纸业的纸浆生产中，将纤维性原料在存在化学制品的情况下进行高温和高压处理。这种处理将纤维转化为纸浆，称为制浆。在制浆后，将纸浆漂白。木聚糖酶用于增强对纸浆的漂白作用。木聚糖酶处理使得随后的漂白化学制品如氯，二氧化氯，过氧化氢或者这些化学制品的组合更有效地漂白纸浆。用木聚糖酶对纸浆预处理提高最终纸制品的白度和质量，并减少必须用于漂白纸浆的基于氯的化学制品的数量。这反过来降低了通过这种方法产生的含氯污水。最重要的化学制浆方法是牛皮纸浆。针对牛皮纸浆，在制浆之后及在用木聚糖酶处理纸浆之前，纸浆处于大约55-70℃及在高碱性pH下(例如Nissen等，1992)。许多可商购的野生型木聚糖酶的缺点是这些酶呈现酸性的最佳pH及大约55℃的最佳温度。因此，为有效利用木聚糖酶进行漂白，纸浆必须酸化为与使用的特异性木聚糖酶的最佳pH相近的pH。另外，热纸浆必须冷却至接近选择的木聚糖酶的酶活性的最佳温度。针对木聚糖酶处理而降低纸浆温度降低了随后化学漂白的效力。酸化纸浆需要使用大量酸。另外，加入酸产生侵蚀，这使加工设备的寿命降低。因此，在接近纸浆条件的温度和pH条件下活性最佳的木聚糖酶在纸浆生产中是有用及有益的。在较高温度呈现较高活性的木聚糖酶可用于在制浆之后立即处理纸浆，而不需要将纸浆冷却。相似地，在较高pH条件下呈现较高活性的木聚糖酶很少或不需要酸中和纸浆。分离或遗传处理具有这种性质的木聚糖酶为许多工业处理提供了一些有利条件和实际的经济益处。针对改良用于现有
的纸浆漂白中的木聚糖酶的一些方法包括从在80-100℃生长的极端嗜热生物中分离热稳定的木聚糖酶，所述生物如Caldocellum saccharolyticum，Thermatoga maritima和Thermatoga sp.Strain FJSS-B.1(Luthi等1990；Winterhalter等1995；Simpson等1991)。然而，这些热稳定的木聚糖酶较大，分子量在35-120kDa(320-1100个残基)，并与呈现较好穿透纸浆纤维的其它较小木聚糖酶相比呈现穿透纸浆的能力下降。另外，一些极度嗜热的木聚糖酶，如Caldocellum saccharolyticum木聚糖酶A呈现木聚糖酶和纤维素酶双重活性(Luthi等1990)。这种额外的分解纤维素活性在纸浆漂白中是不需要的，因为其对造纸大批原料，纤维素具有不利作用。另外，在极高温度具有正常功能的超耐热木聚糖酶在最佳纸浆漂白温度范围具有低特异性活性(Simpson等1991)。许多木聚糖酶通过蛋白质工程已经加以修饰以改良其工业应用性质。例如U.S.5,759,840(Sung等)和U.S.5,866,408(Sung等)揭示了里氏木霉(Trichoderma reesei)木聚糖酶II(TrX)的N末端区域(1-29残基)中的突变。发现在TrX的第10，27和29位残基的三个突变提高了木聚糖酶在提高的温度和碱性pH条件下的酶活性。U.S.5,405,769(Campbell等)揭示了使用定点诱变修饰环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)木聚糖酶(BcX)以改良酶的热稳定性。位点特异的诱变包括用Cys残基置换两个氨基酸以产生分子内二硫键。另外，突变酶的N末端中特异的残基，也发现进一步改良了酶的热稳定性。在体外分析中，二硫突变物显示在62℃具有热稳定性，比天然BcX木聚糖酶提高7℃。然而，这些热稳定二硫突变物在随后的研究的实验室分析中显示未获得嗜热性(Wakarchuck等，1994)。在BcX木聚糖酶的N末端附近的突变T3G(即在第3位的苏氨酸用Gly置换；BcX木聚糖酶氨基酸编号)，D4Y(F)和N8Y(F)提供了在57℃的热稳定性，比天然BcX提高2℃(U.S.5,405,769)。然而，这些酶在工业中的应用仍需要在预处理后和加入酶之前冷却及酸化纸浆。因此，仍需要进一步提高热稳定性，嗜热性和pH最佳值。Turnnen等(2001)揭示了在TrX的11，38和162位的突变(N11D，N38E，Q162H)，与二硫键互补相似(S110C/N154C)，来改良木聚糖酶的热稳定性。然而，包括N11D的这些突变对木聚糖酶的嗜热性和嗜碱性也具有不利作用，导致与天然TrX II相比在较高温度和中性-碱性pH值下酶的活性降低。 现有
需要获得新的适于工业应用的木聚糖酶，其在提高的温度和pH条件下呈现提高的酶活性。本专利技术的目的是克服现有
的缺点。上述目的通过主权利要求的特征组合而体现，从属权利要求进一步揭示了本专利技术有利的实施方案。专利技术概述本专利技术涉及木聚糖酶。更特别地，本专利技术涉及木聚糖酶，及修饰的木聚糖酶，其在高温及高pH条件下具有改良的性能。本专利技术涉及一种木聚糖酶，其包含至少一个在选自第11，116，118，144和161位氨基酸的位置上的取代的氨基酸残基，所述位置从修饰的木聚糖酶与SEQ ID NO16所示的里氏木霉木聚糖酶II氨基酸序列的对比中确定。优选地，所述木聚糖酶与相应的天然TrX木聚糖酶相比呈现改良的嗜热性，嗜碱性，更宽的有效pH范围，表达效率或其组合。本专利技术还提供了上述木聚糖酶，其中所述木聚糖酶是修饰的木聚糖酶，而且至少一个取代的氨基酸残基在第116位。优选地，取代的氨基酸是Gly。本专利技术还包含如上述在第116位修饰的木聚糖酶，而且其进一步包含在第10和105位的His，在第27位的Met，在第29位的Leu，在第75和125位的Ala，在第129位的Glu及在第144位的Arg。本专利技术包括如上述在第116位修饰的木聚糖酶，而且其进一步包含在第10和105位的His，在第27位的Met，在第29位的Leu，在第75和125位的Ala，在第129位的Glu及在第144位的Arg。本专利技术描述了如上述在第116位修饰的木聚糖酶，并且其进一步包含在第10和105位的His，在第11位的Asp，在第27位的Met，在第29位的Leu，在第75和125位的Ala，在第129位的Glu及在144和161位的Arg。本专利技术还提供了如上述修饰的木聚糖酶，其中至少一个取代的氨基酸残基在第144位。优选所述取代的氨基酸是Arg。本专利技术包含如上述在第144位修饰的木聚糖酶，并且其进一步包含在第10和105位的His，在第27位的Met，在第29位的Leu，在第75和125位的Ala及在第129位的Glu。本专利技术还提供了如上述修饰的木聚糖酶，其中至少一个取代的氨基酸在161位。优选所述取代的氨基酸是Arg。本专利技术包含如上述在161位修饰的木聚糖酶，并且其进一步包含在第10和105位的His，在第27位的Met，在第29位的Leu，在第75和125位的Ala，在第129位的Glu及在第144位的Arg。本专利技术还提供了如上述本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种修饰的木聚糖酶，其包含至少一个在选自第１１，１１６，１１８，１４４或１６１位氨基酸的位置上的取代的氨基酸残基，所述位置从所述修饰的木聚糖酶与ＳＥＱＩＤＮＯ：１６所示里氏木霉（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）木聚糖酶Ⅱ氨基酸序列的序列对比中确定。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋永霖，
申请(专利权)人：加拿大国立研究院，
类型：发明
国别省市：CA[加拿大]