提高木聚糖酶嗜热性、嗜碱性和热稳定性的修饰制造技术

本发明专利技术涉及生产在纸浆的漂白中有卓越性能的木聚糖酶，更具体地说，本发明专利技术涉及比天然木聚糖酶显示更高的嗜热性，嗜碱性和热稳定性的修饰的家族１１木聚糖酶。修饰的木聚糖酶包含下述三种类型的修饰中的任何一种：（１）改变里氏木霉（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　　ｒｅｅｓｅｉ）木聚糖酶Ⅱ的氨基酸１０，２７，和２９或另外一个家族１１木聚糖酶的相应的氨基酸；（２）用来自另外一个木聚糖酶的氨基酸取代Ｎ－末端区的氨基酸；（３）Ｎ－末端的多至１０个氨基酸的上游延伸。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术的领域是通过蛋白质工程修饰蛋白质。具体来说，本专利技术涉及耐高温和高pH的经过修饰的木聚糖酶。木聚糖酶用于增强纸浆的漂白以制造白色的纸张。本专利技术使生产的木聚糖酶具有与家族11木聚糖酶相关的增强漂白能力，但在高温和高pH时仍保持活性，比目前使用的木聚糖酶更适于纸浆厂的操作需要。
技术介绍
自从1991年以来，木聚糖酶一直用于增强纸浆的漂白以生产亮白的纸张。在纸浆漂白之前将这些酶加入纸浆，清除纸浆中的木聚糖部分。此程序使随后的漂白试剂，包括氯气，二氧化氯，过氧化氢，氧，臭氧和氢氧化钠，比没有木聚糖酶处理程序更有效地漂白纸浆。漂白效率的增强使得工厂减少了氯基试剂的用量，从而降低了工厂废水中有毒有机氯化合物的量，使得能生产更白的纸浆或降低工厂在漂白剂方面的开支。木聚糖酶用于漂白的商业用途综述于Tolan，et al，Pulp and PaperCanada，December 1995。已有近100种微生物中报道存在木聚糖酶。木聚糖酶分属于糖基水解酶40多个家族中的几个。糖基水解酶，包括木聚糖酶，甘露聚糖酶，淀粉酶，β-葡聚糖酶，纤维素酶和其它碳水化合物水解酶，是根据诸如氨基酸序列，三维结构和催化位点的几何学等性质进行分类的(Gilkes，et al，(1991)Microbiol.Reviews 55303-315)。对纸浆漂白有特殊用处的是归类于家族11的酶。此家族中的所有酶均为木聚糖酶并以“家族11木聚糖酶”而著称。它与一些出版物中使用的家族G木聚糖酶同义，但是我们将使用术语家族11。表1列出了目前已知的家族11木聚糖酶。其中的大多数分子量约为21,000道尔顿。家族11木聚糖酶中的三个-粪堆梭菌(Clostridium stercorarium)XynA，变青链霉菌XynB，和褐色热单胞XynA-具有31,000至50,000道尔顿的较高的分子量。但是，这些木聚糖酶与其它家族11木聚糖酶类似具有一个约21,000道尔顿的催化核心序列。家族11木聚糖酶的氨基酸序列(或者，对较大的酶来说，催化核心的序列)显示高度的相似性(图1)。来源于细菌，酵母或真菌的家族11木聚糖酶具有同样的通用分子结构(参见CAMPBELL等的美国专利5,405,769中的图2)。表1.家族11木聚糖酶微生物木聚糖酶黑曲霉 XynA川地曲霉 XynC塔宾曲霉 XynA环状芽孢杆菌 XynA短小芽孢杆菌 XynA枯草芽孢杆菌 XynA粪肥纤维单胞菌(Cellulomonas fimi) XynD钦氏菌 Xyn丙酮丁醇梭状芽孢杆菌 XynB粪堆梭菌(Clostridium stercorarium) XynA产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes) XynCNeocallimastix patriciarum XynA达松维尔拟诺卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei) XynII产黄瘤胃球菌 XynA群交裂褶菌 Xyn变青链霉菌 XynB变青链霉菌 XynC链霉菌36a号菌种Xyn嗜热紫链霉菌 XynII褐色热单胞 XynA哈茨木霉(Trichoderma harzianum)Xyn里氏木霉(Trichoderma reesei) XynI里氏木霉 XynII绿色木霉 Xyn如果一个酶具有家族11的共有氨基酸，包括两个作为关键催化残基的谷氨酸(E)，那么这个酶就被归类于家族11。这些E残基按Trichoderma reesei xynII的编号是氨基酸86和177。通过一种本领域熟练技术人员所熟知的方法-氨基酸序列对比可以容易地确定其它家族11木聚糖酶的关键E残基的相应位置。家族11木聚糖酶共有的氨基酸用黑体字标示于图1(Wakarchuk，et al，Protein Science 3467-475(1994))。在用于纸浆漂白时，家族11木聚糖酶有几点优于其它木聚糖酶。家族11木聚糖酶中的大多数都比其它家族的木聚糖酶小，与其它木聚糖酶相比较小的分子量可能有助于穿透纸浆纤维以从纸浆中释放出木聚糖并增强漂白作用。就其催化活性而论，家族11木聚糖酶是“纯的”木聚糖酶，与其它家族的木聚糖酶不同，这些酶只水解木聚糖而不水解纤维素。纤维素的水解破坏了纸浆，工厂不能接受。在家族11木聚糖酶中，用木材腐败真菌木霉制造的木聚糖酶已经被最广泛地用于增强纸浆漂白。尤其是，Trichoderma reesei木聚糖酶II(Xyn II)已被广泛使用，其分子量为21,000，等电点为9.1。家族11木聚糖酶除了用于纸浆漂白的优点外，这些酶还有显著的缺点。这些酶对纸浆显示活性的温度和pH范围是45℃-55℃和pH5.0-7.5。一小部分工厂按传统的方法在这些范围内进行操作。但是，典型的纸浆处于60℃-70℃和pH10-12。在一些工厂中温度和pH的调节是可以接受的和常规的。但是，在很多工厂获得期望的处理条件会引起严重的问题。根据如何实施漂白，将纸浆冷却到低于60℃的温度会使漂白效率降低到一个不可接受的程度。例如，如果一个工厂正在完全用二氧化氯漂白并在氯化塔中保留时间少于20分钟，那么充分漂白的最低温度是60℃。如果这个工厂不能在酶处理和氯化之间加热纸浆(这是经常的情况)，那么降低温度用于酶处理阶段是不可接受的。硫酸用于控制纸浆的pH。鉴于设备的金属属性，使用硫酸控制pH会腐蚀钢管和其它设备，硫酸还危及安全。另外一个在漂白中使用这些酶，尤其是Trichoderma reesei木聚糖酶的次要问题是低的热稳定性。贮存几周后工厂中的温暖的环境温度有可能使这些酶失活。这个问题不如调整纸浆的温度和pH的问题重要，但是也必须考虑使用冷冻贮存或在酶中加入稳定剂化合物。因此，希望的是使用在比Trichoderma reesei Xyn II更高pH和温度范围时有活性的木聚糖酶，尤其是家族11木聚糖酶。这将允许工厂能够在木霉木聚糖酶的活性范围之外运转以实施木聚糖酶处理并从本文理中获得好处，还会使工厂用比目前状况更少的硫酸和冷却水来实施木聚糖酶处理，节省了生产消耗并提高了可控制性和贮存稳定性。在讨论改进木聚糖酶的性能所采用的方法之前，定义下列术语是有帮助的。嗜热性在本文被定义为在高温时酶保持活性的能力。例如，如果木聚糖酶#1比木聚糖酶#2能在更高的温度中水解木聚糖，木聚糖酶#1就具有比木聚糖酶#2更高的嗜热性。嗜热性涉及有底物时的酶活性。在本专利技术中，底物可以是纸浆木聚糖或纯的木聚糖。为了定义嗜热性，阐明底物是重要的。在较高温度时大多数木聚糖酶水解纯的木聚糖的效率高于纸浆处理。这是由于底物相关因子(即纸浆中存在的抑制剂)，处理时间，pH，和用于进行测试程序的其它方面联合起作用造成的。除非另有描述，本文所指的嗜热性的定量测定是用纯的木聚糖作底物。热稳定性在本文被定义为待储存的酶在不存在木聚糖底物时高温温育，当回到标准分析状态时显示木聚糖酶活性的能力。例如，如果木聚糖酶#1可在70℃保温24小时并保留所有活性，而木聚糖酶#2经过70℃24小时后失去所有活性，就可以说木聚糖酶#1的热稳定性高于木聚糖酶#2。与嗜热性相反，热稳定性涉及无木聚糖底物温育后保留的酶活性。明确地本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种修饰的木聚糖酶，选自如下一组：木霉、曲霉、链霉菌和芽孢杆菌的家族１１木聚糖酶，其在根据里氏木霉木聚糖酶Ⅱ的氨基酸编号的位置１４或其它木聚糖酶的在氨基酸对比时相应的位置上具有酪氨酸或苯丙氨酸，所说的木聚糖酶已经被修饰以展示增强的嗜热性，嗜碱性或热稳定性，所作的修饰是将所说的木聚糖酶的Ｎ－末端区的一段氨基酸序列用褐色热单胞木聚糖酶Ａ的一段对比相应的氨基酸序列取代以形成一个嵌合木聚糖酶。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋L荣，矢口诚，石川和彦，
申请(专利权)人：加拿大国立研究院，
类型：发明
国别省市：CA[加拿大]