本发明专利技术公开了一种耐热酯酶基因、含有该基因的工程菌及其编码蛋白和应用，该酯酶基因estA'碱基序列为SEQ ID NO.1，将基因estA'与质粒连接构建重组表达载体pET28b‑estA'，表达质粒转化大肠杆菌构建重组工程菌Rosetta(DE3)pLysS/pET28b‑estA'；酯酶在大肠杆菌中获得异源表达，采用对硝基苯酚法鉴定酯酶EstA的酶学性质，具有高度热稳定性，本发明专利技术的目的是为该酯酶的生产及其在医药、食品、精细化工等领域的工业应用提供服务，尤其是在需要高温催化时，该酶更为适宜。
Heat resistant esterase gene, engineering bacteria containing the gene, encoded protein and application thereof
The invention discloses a heat-resistant esterase gene, an engineering bacterium containing the gene, and its coding protein and application. The esterase gene estA'base sequence is SEQ ID NO.1. The recombinant expression vector pET28b_estA'is constructed by connecting the gene estA'with the plasmid, and the expression plasmid is transformed into E. coli to construct a recombinant engineering bacterium Rosetta (DE3) pLys S/pET28b. EstA'; esterase is heterologous expressed in E. coli. The esterase EstA is characterized by p-nitrophenol method and has high thermal stability. The purpose of the present invention is to provide services for the production of the esterase and its industrial applications in medicine, food, fine chemicals and other fields, especially when high temperature catalysis is needed. The enzyme is more suitable.
【技术实现步骤摘要】
一种耐热酯酶基因、含有该基因的工程菌及其编码蛋白和应用
本专利技术属于生物工程
，涉及基因、编码蛋白工程
，具体涉及一种耐热酯酶基因、含有该基因的工程菌及其编码蛋白和应用。
技术介绍
酯酶(Esterases,EC3.1.1.X)是一类能够催化酯键水解和形成的酶类，广泛分布于动物、植物和微生物。作为重要的工业用酶，酯酶目前已被广泛应用于医药化工、食品工业、精细化工、生物能源、农业和环境治理等领域。随着酯酶应用范围的不断拓宽，现己成为世界工业酶制剂市场上继蛋白酶、淀粉酶之后第三大工业用酶。但是酯酶工业生产条件较为粗放，因此为了节省生产成本，寻求高热稳定性、高催化效率的酯酶一直是人们努力的目标。链霉菌(Streptomyces)属于放线菌目链霉菌科链霉菌属，是一类存在于土壤中的好氧、丝状、产孢子的革兰氏阳性细菌。链霉菌具有丰富的次级代谢途径，可以产生大量的具有重要经济价值的次级代谢物，如抗生素、水解酶类、酶抑制剂、除草剂和抗肿瘤药物等，是极其重要的工业生产菌。链霉菌基因组的大小为5.5Mb-8.6Mb，约为大肠杆菌基因组的2倍，G+C含量高达70％-74％。链霉菌中含有丰富的酯酶基因，这些序列信息为研究者们提供了丰富的资源，但对它们的研究目前还比较少。研究者可根据这些序列信息克隆相应的酯酶基因，并对它们进行异源表达和酶学性质研究。但由于链霉菌基因的高GC含量及较为复杂的蛋白质翻译系统，使链霉菌的基因在异源宿主中的表达常常受限。目前只有少数种类的酯酶基因在异源表达系统如大肠杆菌(Escherichiacoli)、变铅青链霉菌、酿酒酵母(Saccharomvcescerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)中获得较好的表达。酯酶基因的非翻译区，酯酶前肽和信号肤的存在、密码子的差异以及不同表达系统表达重组酯酶的糖基化等都会影响酯酶基因的异源表达。特别是大肠杆菌，其作为低等的原核生物，缺乏完善的翻译后修饰系统，酯酶在其中常无法表达或以包涵体形式存在，极少获得活性蛋白。变铅青链霉菌(Streptomyceslividands)TK24全基因组(CompleteGenome)核苷酸序列在GenBank数据库，登录号(Accessionnumber)为CP009124，该基因组大小为8.3Mb，G+C含量高达72.2％。本专利技术所研究基因为染色体(NZ_CP009124)上的基因座(Locustag)SLIV_RS27090，在染色体上的核苷酸序列起始位点(Start)为6057885，终止位点(Stop)为6058688。依据基因组序列诠释该段核苷酸序列所编码蛋白质产物为酯酶，蛋白质产物(Proteinproduct)编号(Accession)为WP_003976692，在GenBank中的蛋白质登录号为AIJ16329。该段序列全长804bp，起始密码子(Initiationcodon)为TCA，终止密码子(Stopcodon)为CAC，GC含量为72.5％，体现了链霉菌基因组的高GC含量特征。
技术实现思路
根据以上现有技术的不足，本专利技术所要解决的技术问题是提出了一种耐热酯酶基因，含有该基因的工程菌及其编码蛋白和应用，为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：一种耐热酯酶基因，该耐热酯酶基因具有SEQIDNO.1的碱基序列，且能在异源宿主大肠杆菌中成功表达。一种重组质粒，该重组质粒含有所述的耐热酯酶基因的pET-28b(+)重组质粒。一种耐热酯酶基因重组工程菌，该工程菌为大肠杆菌且含有所述的重组质粒表达载体。优选的，该工程菌表达耐热酯酶蛋白的条件为0.01-0.5mM的IPTG诱导浓度及16℃-30℃的诱导温度。一种耐热酯酶基因的编码蛋白，该编码蛋白具有SEQIDNO.2的氨基酸序列。优选的，该编码蛋白的反应温度为30-60℃，反应pH为7-9，100℃下活性半衰期≥6h。优选的，该编码蛋白的反应温度为55℃，反应pH为8.5，100℃下活性半衰期为6h。一种耐热酯酶基因的编码蛋白的应用，该编码蛋白应用在医药、食品和精细化工领域。与现有技术相比，本专利技术的有益效果：1.本专利技术将变铅青链霉菌TK24染色体上的基因座SLIV_RS27090核苷酸序列进行优化，获得了核苷酸序列所编码氨基酸保持不变，但804个核苷酸序列中609个核苷酸发生了变化，占整个基因的75.7％，GC含量也由菌株中的原始核苷酸占比的72.5％下降至53.4％，有利于优化基因在大肠杆菌的表达。2.本专利技术将优化后的基因estA'与pET28b质粒连接，成功构建具Kan抗性的重组表达载体pET28b-estA'。3.本专利技术将该重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞，成功构建用于estA'表达的基因工程菌Rosetta(DE3)pLysS/pET28b-estA'，该重组工程菌同时具备Kan和Cam抗性。4.本专利技术采用Co2+离子亲和层析法及SDS-PAGE电泳，获得高度纯化酯酶蛋白EstA，获得的酯酶蛋白EstA具有高度热稳定性，可应用于医药、食品和精细化工等领域。附图说明1.图1是酯酶estA基因与优化后的estA'的序列比对图；2.图2是SDS-PAGE分析EstA的表达；3.图3是EstA活性与反应pH趋势图；4.图4是EstA活性与反应温度趋势图；5.图5是EstA在55℃下的热稳定性趋势图；6.图6是EstA在100℃下的热稳定性趋势图。M、蛋白质Marker，1、IPTG诱导的粗酶液，2、纯化的EstA蛋白，■、pH6.0-7.0的Na-citratebuffer，●、pH7.0-9.0的Tris-HClbuffer，▲、pH9.0-10.5的KH2PO4-NaOHbuffer。具体实施方式下面通过对实施例的描述，作进一步详细的说明，以帮助本领域技术人员对本专利技术的专利技术构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解。需要阐明的：本专利技术将基因座(Locustag)SLIV_RS27090编码酯酶基因命名为estA，优化后的酯酶基因命名为estA'，由于estA及estA'所编码蛋白质的氨基酸组成相同，故将其编码的氨基酸统一命名为EstA。实施例中用到的标准测定体系为1mL，由980μL50mMpH8.0的Tris-HCl，10μL0.5mM的对硝基苯酚丁酸酯,10μL的酶液构成。实施例11.对变铅青链霉菌TK24酯酶基因estA进行优化、合成理论指导：变铅青链霉菌TK24酯酶estA基因全长804bp，起始密码子为TCA，终止密码子为CAC；A碱基122个，占比15.2％；T碱基99个，占比12.3％；C碱基297个，占比36.9％；G碱基286个，占比35.6％；GC含量为72.5％，体现了变铅青链霉菌基因组的高GC含量特征。由于estA基因高的GC含量，严重影响该蛋白在大肠杆菌中的表达，且变铅青链霉菌酯酶为次生代谢蛋白，在表达过程中可能需要分子伴侣协助其折叠，因而该基因在大肠杆菌中的表达出现障碍，无法完成在大肠杆菌中的异源表达,为了解决这一问题，在表达相同氨基酸序列的前提下，我们对酯酶estA基因的核苷酸序列进行了优化，尽量降低该基因的GC含量，同时以大肠杆菌偏爱密码子代替其稀有密码子,此外，为使该基因与载体p本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种耐热酯酶基因，其特征在于，该耐热酯酶基因具有SEQ ID NO.1的碱基序列，且能在异源宿主大肠杆菌中成功表达。
【技术特征摘要】
1.一种耐热酯酶基因，其特征在于，该耐热酯酶基因具有SEQIDNO.1的碱基序列，且能在异源宿主大肠杆菌中成功表达。2.一种重组质粒，其特征在于，该重组质粒含有权利要求1所述的耐热酯酶基因的pET-28b(+)重组质粒。3.一种耐热酯酶基因重组工程菌，其特征在于，该工程菌为大肠杆菌且含有权利要求2所述的重组质粒表达载体。4.根据权利要求3所述的耐热酯酶基因重组工程菌，其特征在于，该工程菌表达耐热酯酶蛋白的条件为0.01-0.5mM的IPTG诱导浓度及16℃-30℃的诱导温度。5.一种权...
【专利技术属性】
技术研发人员：王宝娟，王敖，李全发，王源秀，朱国萍，王鹏，吴爽，曹正宇，张婷，
申请(专利权)人：安徽师范大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34
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