基于上转换荧光免疫传感器的阿特拉津检测试剂盒及应用和阿特拉津检测方法技术

本发明专利技术属于食品安全检测免疫分析技术领域，涉及一种基于上转换荧光免疫传感器的阿特拉津检测试剂盒及应用和阿特拉津检测方法。该试剂盒包括以下组分：(1)羧基化核/壳型上转换纳米颗粒NaYF4:Yb,Er@NaYF4:Nd；(2)抗阿特拉津单克隆抗体；(3)黑磷纳米金复合材料分散液。利用该试剂盒或该检测方法，能够高灵敏的检测阿特拉津。

Atrazine detection kit based on up-conversion fluorescence immunosensor and its application

The invention belongs to the field of food safety detection immunoassay technology, and relates to an atrazine detection kit based on up-conversion fluorescence immunosensor and an application and an atrazine detection method. The kit consists of the following components: (1) carboxylated core/shell upconversion nanoparticles NaYF4:Yb, Er@NaYF4:Nd; (2) anti-atrazine monoclonal antibody; (3) black phosphorus nanogold composite dispersion. The test kit can be used for the detection of atrazine with high sensitivity.

【技术实现步骤摘要】
基于上转换荧光免疫传感器的阿特拉津检测试剂盒及应用和阿特拉津检测方法
本专利技术属于食品安全检测免疫分析
，更具体地，涉及一种基于上转换荧光免疫传感器的阿特拉津检测试剂盒及应用和一种基于上转换荧光免疫传感器的阿特拉津检测方法。
技术介绍
阿特拉津(atrazine)，别名莠去津，作为一种广谱除草剂，可防除多种一年生禾本科和阔叶杂草，适用于玉米、高粱、甘蔗、果树、苗圃、林地等旱田作物。然而，大规模的使用阿特拉津会通过各种途径污染食物和饮用水，导致严重的健康风险。美国环境保护署报道，阿特拉津摄入过量可能诱发至关重要的疾病，如低血压、肌肉痉挛和肾上腺损伤。目前，在地下水和地表水中均能检测到阿特拉津残留。因此，世界卫生组织(WHO)制订了饮用水中阿特拉津的最大残留水平(MRLs)为2μgL-1。目前已建立起的阿特拉津的检测方法主要包括大型仪器分析方法(HPLC，HPLC/MS等)，生物传感器，免疫分析等。大型仪器方法需要昂贵的仪器，耗时的样品预处理以及复杂的检测程序。而ELISA作为传统免疫分析检测方法已经在部分地区广泛使用，但在实际样品(如玉米、甘蔗等)的检测过程中，容易受到食品中复杂成分的影响，从而使得该方法在检测的灵敏度和准确性上仍存在一定的缺陷。因此，建立食品中阿特拉津的高灵敏度检测方法对于绿色农业生产及保障民生健康具有十分重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于上转换荧光免疫传感器的阿特拉津检测试剂盒及应用和一种基于上转换荧光免疫传感器的阿特拉津检测方法，利用该试剂盒或该检测方法，能够高灵敏的检测阿特拉津。为了实现上述目的，本专利技术提供一种基于上转换荧光免疫传感器的阿特拉津检测试剂盒，该试剂盒包括以下组分：(1)羧基化核/壳型上转换纳米颗粒NaYF4:Yb,Er@NaYF4:Nd(绿色)；(2)抗阿特拉津单克隆抗体；(3)黑磷纳米金复合材料分散液。根据本专利技术，所述羧基化核/壳型上转换纳米颗粒和所述抗阿特拉津单克隆抗体可分别提供，也可以羧基化核/壳型上转换纳米颗粒偶联抗阿特拉津单克隆抗体的形式提供。本专利技术的原理是采用上转换标记单克隆抗体与目标物特异性结合的免疫分析模式。制备羧基化核/壳型上转换纳米颗粒(绿色)，构建“上转换/抗体”结构复合物。制备出吸收全波长可见光的“黑磷纳米金复合材料”，实现对“上转换/抗体”结构复合物的快速吸附，通过荧光共振能量转移将“上转换/抗体”结构复合物的荧光猝灭。目标物阿特拉津可被单克隆抗体特异性识别，从而引起抗体构象改变，“黑磷纳米金复合材料”吸附蛋白能力降低，从而导致“上转换/抗体”结构复合物荧光猝灭强度降低。利用荧光定量检测“上转换/抗体”结构复合物的荧光强度实现对阿特拉津的间接定量。基于上述原理，所述羧基化壳/核型上转换纳米颗粒NaYF4:Yb,Er@NaYF4:Nd(绿色)粒径为350-400nm，特定尺寸的颗粒能够进一步提高检测的灵敏度。本专利技术中阿特拉津单克隆抗体既要具有一定特异性识别阿特拉津的活性，又要能够与上转换颗粒偶联用于后续检测。本专利技术可以采用任何能够实现上述目的的阿特拉津单克隆抗体。根据本专利技术，所述羧基化核/壳型上转换纳米颗粒NaYF4:Yb,Er@NaYF4:Nd通过包括以下步骤的方法制备：(1)合成上转换纳米颗粒内核：将氧化钇、氧化镱、氧化铒分别与三氟乙酸反应，制得三种三氟乙酸化物，然后将三种三氟乙酸化物与三氟乙酸钠、油酸、1-十八烯和油胺混合反应，制得所述上转换纳米颗粒内核；(2)制备核/壳型上转换纳米颗粒：将所述上转换纳米颗粒内核分散于有机溶剂中，加入三氟乙酸钠、三氟乙酸钇、三氟乙酸钕、油酸、1-十八烯进行反应，制得所述核/壳型上转换纳米颗粒；(3)制备羧基化核/壳型上转换纳米颗粒：将聚丙烯酸溶液与核/壳型上转换纳米颗粒混合，制得所述羧基化核/壳型上转换纳米颗粒。根据本专利技术，所述黑磷纳米金复合材料分散液可通过如下方法制得：将黑磷晶体粉末与聚乙烯吡咯烷酮水溶液混合，超声条件下进行反应，反应后离心去除未剥离完全的黑磷晶体沉淀，得到黑磷纳米片；将黑磷纳米片洗净后超声分散于水中，加入氯金酸水溶液，震荡混合反应，离心去上清，清洗沉淀后分散于水中，得到所述黑磷纳米金复合材料分散液。本专利技术中所述黑磷纳米金复合材料的厚度为15nm。特定层数(5-10层)的黑磷纳米片分散液可以满足原位合成黑磷纳米金复合材料的要求。本专利技术的第二方面提供上述阿特拉津检测试剂盒在检测阿特拉津中的应用。本专利技术的第三方面提供一种基于上转换荧光免疫传感器的阿特拉津检测方法，该方法包括以下步骤：1)建立阿特拉津标准曲线：1-1)将羧基化核/壳型上转换纳米颗粒偶联抗阿特拉津单克隆抗体用封闭液封闭，离心去上清后用PBS溶液洗涤，复溶于PBS溶液中；1-2)加入多个浓度梯度的阿特拉津标准品溶液，震荡孵育；1-3)离心去除未连接的小分子，用PBS溶液反复洗涤，复溶于PBS溶液中；1-4)加入黑磷纳米金复合材料分散液，剧烈震荡反应，反应结束后离心，用PBS溶液洗涤，除去未连接的黑磷纳米金；1-5)加入PBS溶液，进行荧光检测，绘制阿特拉津标准品的浓度与荧光猝灭值的标准曲线；2)待测样品中阿特拉津的检测：2-1)将羧基化核/壳型上转换纳米颗粒偶联抗阿特拉津单克隆抗体用封闭液封闭，离心去上清后用PBS溶液洗涤，复溶于PBS溶液中；2-2)加入含有阿特拉津的待测样品，震荡孵育；2-3)离心去除未连接的小分子，用PBS溶液反复洗涤，复溶于PBS溶液中；2-4)加入黑磷纳米金复合材料分散液，剧烈震荡反应，反应结束后离心，用PBS溶液洗涤，除去未连接的黑磷纳米金；2-5)加入PBS溶液，进行荧光检测；2-6)根据步骤1)绘制的标准曲线，根据检测到的荧光猝灭值计算待测样品中阿特拉津的浓度。其中，所述多个浓度梯度的阿特拉津标准品溶液的浓度范围优选为0.01-1000ng/mL。本专利技术的试剂盒和方法能够高灵敏的、高特异性的实现样品中阿特拉津的检测。检测限可达到9.2pg/mL。本专利技术的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。附图说明通过结合附图对本专利技术示例性实施方式进行更详细的描述，本专利技术的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。图1为上转换颗粒和上转换颗粒偶联单抗后的荧光光谱图。图2为黑磷以及黑磷纳米金分散液的紫外吸收光谱图。图3为以阿特拉津标准品的浓度为横坐标，各浓度对应的荧光猝灭值为纵坐标绘制的标准曲线。图4为基于上转换荧免疫传感器检测阿特拉津特异性实验的响应图。具体实施方式下面将更详细地描述本专利技术的优选实施方式。虽然以下描述了本专利技术的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本专利技术而不应被这里阐述的实施方式所限制。实施例中未注明的具体条件者，皆按照常规条件或制造商建议的条件进行，实验中所用到的阿特拉津及其类似物标准品购自百灵威公司，鼠抗阿特拉津单克隆抗体由本实验室制备并纯化(王彩红。阿特拉津与氨苄青霉素单抗制备、鉴定及ELISA方法的初步建立[D].北京：中国人民解放军军事医学科学院，2010：42-66.)。黑磷晶体粉末购自先丰纳米公司。F97Pro荧光分光光度计购自上海棱光技术有限公司。实施例1一、核/壳上转换颗粒标记抗阿特拉津抗体的制备1)核/壳上转换颗粒(Na本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于上转换荧光免疫传感器的阿特拉津检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括以下组分：(1)羧基化核/壳型上转换纳米颗粒NaYF4:Yb,Er@NaYF4:Nd；(2)抗阿特拉津单克隆抗体；(3)黑磷纳米金复合材料分散液。

【技术特征摘要】
1.一种基于上转换荧光免疫传感器的阿特拉津检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括以下组分：(1)羧基化核/壳型上转换纳米颗粒NaYF4:Yb,Er@NaYF4:Nd；(2)抗阿特拉津单克隆抗体；(3)黑磷纳米金复合材料分散液。2.根据权利要求1所述的基于上转换荧光免疫传感器的阿特拉津检测试剂盒，其中，所述羧基化核/壳型上转换纳米颗粒和所述抗阿特拉津单克隆抗体以羧基化核/壳型上转换纳米颗粒偶联抗阿特拉津单克隆抗体的形式提供。3.根据权利要求1所述的基于上转换荧光免疫传感器的阿特拉津检测试剂盒，其中，所述羧基化核/壳型上转换纳米颗粒的粒径为350-400nm。4.根据权利要求1所述的基于上转换荧光免疫传感器的阿特拉津检测试剂盒，其中，所述羧基化核/壳型上转换纳米颗粒通过包括以下步骤的方法制备：(1)合成上转换纳米颗粒内核：将氧化钇、氧化镱、氧化铒分别与三氟乙酸反应，制得三种三氟乙酸化物，然后将三种三氟乙酸化物与三氟乙酸钠、油酸、1-十八烯和油胺混合反应，制得所述上转换纳米颗粒内核；(2)制备核/壳型上转换纳米颗粒：将所述上转换纳米颗粒内核分散于有机溶剂中，加入三氟乙酸钠、三氟乙酸钇、三氟乙酸钕、油酸、1-十八烯进行反应，制得所述核/壳型上转换纳米颗粒；(3)制备羧基化核/壳型上转换纳米颗粒：将聚丙烯酸溶液与核/壳型上转换纳米颗粒混合，制得所述羧基化核/壳型上转换纳米颗粒。5.根据权利要求1所述的基于上转换荧光免疫传感器的阿特拉津检测试剂盒，其中，所述黑磷纳米金复合材料分散液通过如下方法制得：将黑磷晶体粉末与聚乙烯吡咯烷酮水溶液混合，超声条件下进行反应，反应后离心去除未剥离完全的黑磷晶体沉淀，得...

【专利技术属性】
技术研发人员：王江，高志贤，白家磊，彭媛，任舒悦，李双，宁保安，
申请(专利权)人：军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所，
类型：发明
国别省市：天津,12