一种抗肿瘤组合物及其表达载体和应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，公开了一种抗肿瘤组合物及其共表达载体和应用。本发明专利技术论证了在肿瘤原位，IL‑36γ和PD‑1/PD‑L1信号的阻断剂进行联合，可有效促进肿瘤微环境中的抗肿瘤免疫应答，显著抑制了肿瘤生长，并极大地延长了荷瘤小鼠生存期，开创了一种新型有效的肿瘤免疫疗法，为进一步开发相应的肿瘤免疫制剂奠定了理论和方法基础。

Antitumor composition, expression vector and application thereof

The invention relates to the field of biotechnology, and discloses an anti-tumor composition, a co-expression vector and an application thereof. The invention demonstrates that the combination of IL_36gamma and PD_1/PD_L1 signal blockers in tumor situ can effectively promote the anti-tumor immune response in tumor microenvironment, significantly inhibit tumor growth, greatly prolong the survival time of tumor-bearing mice, and create a new and effective tumor immunotherapy for further development. The corresponding tumor immune agents have laid the foundation for theory and method.

【技术实现步骤摘要】
一种抗肿瘤组合物及其表达载体和应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种抗肿瘤组合物及其表达载体和应用。
技术介绍
肿瘤微环境中的免疫应答往往处于被抑制状态，而采用有效的手段恢复、激活肿瘤浸润免疫细胞的活性有助于抑制肿瘤的进展。肿瘤微环境中，程序死亡性受体1(PD-1，Programmeddeath-1)及其配体PD-L1(Programmeddeathligand-1)构成的免疫卡控点信号介导了对T细胞和NK等免疫细胞的抑制作用，在肿瘤发生中广泛性地抑制了机体的抗肿瘤免疫应答。采用抗体阻断PD-1/PD-L1信号则可以恢复肿瘤微环境中原已存在的T细胞等活性，有助于增强抗肿瘤免疫应答，这在临床上已取得了一定疗效。然而，实际临床治疗中只有少部分肿瘤患者对采用抗体阻断PD-1/PD-L1信号的疗法具有响应，绝大部分患者并无效果，这可能是因为绝大部分患者肿瘤局部T细胞原有数量不足或PD-1/PD-L1负性信号在肿瘤免疫抑制中未占重要地位。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种抗肿瘤组合物及其表达载体，使得所述抗肿瘤组合物能够具备明显的协同增效作用，可抑制肿瘤生长和延长荷瘤小鼠生存期，同时持续促进肿瘤微环境中的抗肿瘤免疫应答；本专利技术的另外一个目的在于提供上述组合物及其共表达载体在制备抗肿瘤药物中的相关应用。为实现上述专利技术目的，本专利技术提供了如下技术方案：一种抗肿瘤组合物，包括IL-36γ和PD-1/PD-L1信号阻断剂。细胞因子IL-36γ可显著促进CD8+T细胞的活化、增殖和效应性因子的分泌，从而对CD8+T细胞的抗肿瘤免疫应答功能具有显著的增强作用。在肿瘤动物模型中，IL-36γ明显抑制肿瘤的生长，并延长荷瘤小鼠的生存期。对临床标本的分析揭示了IL-36γ水平的下调则与肿瘤患者的生存期呈负相关。因此，IL-36γ是应用于肿瘤免疫治疗极具潜在价值的细胞因子，将其在肿瘤局部进行原位应用，不仅可通过主动活化与扩增CD8+T细胞来提高抗肿瘤疗效，而且可以尽可能地减少全身性毒副作用。然而，本专利技术在研究过程中发现，IL-36γ虽能够促进T细胞的功能及其增殖，但PD-1在CD8+T细胞上也呈现高水平表达，而这对肿瘤免疫治疗是不利的。基于本专利技术上述的科研发现，本专利技术提出了所述组合物以及所述组合物联合应用在抗肿瘤治疗中。其中，作为优选，所述PD-1/PD-L1信号阻断剂为可溶性PD-1(sPD-1)。作为优选，IL-36γ和PD-1/PD-L1信号阻断剂的摩尔比为1∶1。为了验证上述组合物在抗肿瘤方面的实际效果，本专利技术通过构建共表达IL-36γ和可溶性PD-1(SolubelPD-1，sPD-1；PD-1分子的胞外段，可通过结合配体PD-L1等阻断PD-1信号)的基因转染黑色素瘤细胞株验证抗肿瘤功效，结果显示，与阴性对照组相比，只表达sPD-1的对照组对肿瘤生长未产生明显抑制作用，只表达IL-36γ的对照组可显著抑制肿瘤的生长，当联合表达IL-36γ、sPD-1时，肿瘤生长则得到进一步极为显著性的抑制，表明IL-36γ联合sPD-1对肿瘤生长起到了协同性抑制作用。同时，对荷瘤小鼠生存期观察结果表明，只表达IL-36γ的对照组可明显延长小鼠生存期，当联合表达IL-36γ、sPD-1时，荷瘤小鼠的生存期得到进一步极为显著性的延长，表明IL-36γ联合sPD-1可对荷瘤小鼠的生存期有协同性延长作用。此外，在早、晚期肿瘤微环境中，IL-36γ联合sPD-1后，其抗肿瘤免疫应答功能进一步得到了显著性的协同促进作用，这说明所述组合物对抗肿瘤免疫应答功能的协同促进持续性地发挥了作用，因此对肿瘤的生长起到了持续性的抑制作用。基于上述试验结果，本专利技术还提供了一种重组载体，包括表达信号肽和IL-36γ的基因序列的重组载体以及表达信号肽和PD-1/PD-L1信号阻断剂的基因序列的重组载体；或者为包含共表达信号肽、IL-36γ和PD-1/PD-L1信号阻断剂的基因序列的重组载体；其中，所述表达信号肽和IL-36γ的基因序列的重组载体以及表达信号肽和PD-1/PD-L1信号阻断剂的基因序列的重组载体之间的摩尔比优选为1∶1，在临床使用时建议用量为2mg；所述包含共表达信号肽、IL-36γ和PD-1/PD-L1信号阻断剂的基因序列的重组载体中，表达IL-36γ和PD-1/PD-L1信号阻断剂的基因序列之间的拷贝数比例优选为1∶1，临床使用时建议用量为1mg。在重组载体中，所述信号肽的序列表达出信号肽，引导IL-36γ和PD-1/PD-L1信号阻断剂分泌到胞外发挥作用(其本身并不会随目标蛋白分泌到细胞外)，根据信号肽促分泌作用的效果，优选用CD8信号肽序列。作为优选，所述PD-1/PD-L1的阻断剂为可溶性PD-1(sPD-1)。在本专利技术具体实施方式中，所述重组载体为质粒，该重组质粒以真核表达载体pCDEF3为基础质粒，在其上引入表达IL-36γ和PD-1/PD-L1抗体的基因序列。同时，基于上述优异的技术效果，本专利技术还提出了所述组合物以及重组载体在制备抗肿瘤药物中的应用，特别是在抗黑色素瘤药物中的应用。由以上技术方案可知，本专利技术论证了在肿瘤原位，IL-36γ和PD-1/PD-L1信号的阻断剂进行联合，可有效促进肿瘤微环境中的抗肿瘤免疫应答，显著抑制了肿瘤生长，并极大地延长了荷瘤小鼠生存期，开创了一种新型有效的肿瘤免疫疗法，为进一步开发相应的肿瘤免疫制剂奠定了理论和方法基础。附图说明图1所示为稳定分泌IL-36γ、sPD-1基因转染细胞株的鉴定结果；其中A为QRT-PCR对转染细胞株IL-36γ表达的鉴定；B为QRT-PCR对转染细胞株sPD-1表达的鉴定；图2所示为IL-36γ联合sPD-1对肿瘤协同抑制作用的结果；其中A为肿瘤生长曲线；B为荷瘤小鼠生存期；图3所示为IL-36γ联合sPD-1后早期肿瘤微环境中CD4+T细胞比例；其中A为肿瘤微环境中CD4+T细胞流式检测代表图；B为CD4+T细胞流式检测分析结果统计图；*p＜0.05，**p＜0.01；图4所示为IL-36γ联合sPD-1后早期肿瘤微环境中CD4+T细胞核增殖抗原Ki67的表达；其中A为肿瘤微环境中CD4+T细胞Ki67表达的流式检测代表图；B为CD4+T细胞Ki67表达的流式检测分析结果统计图；**p＜0.01，***p＜0.001；图5所示为IL-36γ联合sPD-1后早期肿瘤微环境中CD8+T细胞核增殖抗原Ki67的表达；其中A为肿瘤微环境中CD8+T细胞Ki67表达的流式检测代表图；B为CD8+T细胞Ki67表达的流式检测分析结果统计图；*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；图6所示为IL-36γ联合sPD-1后早期肿瘤微环境中CD4+T细胞IFN-γ的表达；其中A为肿瘤微环境中CD4+T细胞IFN-γ表达的流式检测代表图；B为CD4+T细胞IFN-γ表达的流式检测分析结果统计图；*p＜0.05，***p＜0.001；图7所示为IL-36γ联合sPD-1后早期肿瘤微环境中CD8+T细胞IFN-γ的表达；其中A为肿瘤微环境中CD8+T细胞IFN-γ表达的流式检测代表图；B为CD8+T细胞IFN-γ表达的流式检测分析结果统计图；*p＜0.05本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗肿瘤组合物，其特征在于，包括IL‑36γ和PD‑1/PD‑L1信号阻断剂。

【技术特征摘要】
1.一种抗肿瘤组合物，其特征在于，包括IL-36γ和PD-1/PD-L1信号阻断剂。2.根据权利要求1所述组合物，其特征在于，所述PD-1/PD-L1信号阻断剂为可溶性PD-1(sPD-1)。3.根据权利要求1所述组合物，其特征在于，IL-36γ和PD-1/PD-L1信号阻断剂的摩尔比为1∶1。4.权利要求1-3任意一项所述组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述肿瘤为黑色素瘤。6.一种重组载体，其特征在于，包括表达信号肽和IL-36...

【专利技术属性】
技术研发人员：王雪峰，卢斌峰，蒋敬庭，朱一蓓，鲁翰林，申春苹，陈晨，宋盈莹，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32