白介素21（IL-21）在制备抗乙型肝炎病毒药物制剂中的用途制造技术

本发明专利技术属基因工程和生物医药领域，涉及白介素21新的药用用途，具体涉及白介素21在制备抗乙型肝炎病毒制剂中的用途。本发明专利技术经实验证实，通过使用白介素21对乙型肝炎病毒慢性化感染小鼠模型进行干预，可以显著提高乙肝表面抗原（HBsAg）和乙肝e抗原（HBeAg）的转换率，同时能显著降低血清中乙型肝炎病毒DNA载量。白介素21可作为药物前体用于开发新类型抗乙型肝炎病毒药物。

Use of interleukin 21 (IL-21) in the preparation of anti HBV drug preparations

The invention belongs to the field of genetic engineering and biological medicine, which involves the new medicinal use of interleukin 21, and specifically relates to the use of interleukin 21 in preparation of anti HBV preparations. The invention has proved that by using interleukin 21 to intervene the chronic hepatitis B virus chronic infection mouse model, the conversion rate of hepatitis B surface antigen (HBsAg) and hepatitis B e antigen (HBeAg) can be significantly increased, and the DNA load of hepatitis B virus in serum can be significantly reduced. Interleukin 21 can be used as a drug precursor for the development of new types of anti HBV drugs.

【技术实现步骤摘要】
白介素21（IL-21）在制备抗乙型肝炎病毒药物制剂中的用途
本专利技术属基因工程和生物医药领域，涉及白介素21（Interleukin-21，IL-21）新的药用用途，具体涉及白介素21在制备抗乙型肝炎病毒（HepatitisBVirus，HBV）药物制剂中的用途。
技术介绍
现有技术公开了由乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的乙型肝炎以肝脏炎性病变为主，并可并发多器官损害。研究显示，HBV感染慢性化为慢性乙型肝炎（CHB）后，还能引发肝纤维化、肝硬化、原发性肝细胞癌（HCC）和肝衰竭，最终导致死亡。据统计显示，随着HBV疫苗的成熟和预防接种的推广，新发HBV感染率显著下降，但全球仍然有3.5亿左右HBV慢性携带者，每年约1百万患者死于HBV感染相关疾病（Lavanchy2004）；中国属HBV感染高发区，约有1.2亿慢性携带者和3000万慢性乙型肝炎患者（Liuetal.2002）。研究显示，HBV易感宿主仅限于人及黑猩猩。由于动物伦理、经济成本等条件的限制，目前尚无常规实验动物模型能够有效模拟HBV感染、致病等过程。YangPL等的工作（YangPLetal.2002）表明，将具有启动病毒转录复制能力的乙肝病毒1.3倍基因组（1.3mer）插入质粒载体后，利用尾静脉高压水动力注射方法注射入免疫健全小鼠体内可建立HBV急性复制表达小鼠模型；上述模型由于小鼠血清中病毒抗原在注射后10天左右全部转阴，难以用于研究慢性乙型肝炎的形成机制，病毒被快速清除也使得该模型不适合进行抗HBV药物的研发。有研究使用免疫缺陷的小鼠（YangPLetal.2002）或在质粒载体中引入腺相关病毒序列（HuangLRetal.2012），能实现HBV在小鼠肝脏的持续性转录复制，然而由于对宿主免疫缺陷或HBV以外病毒序列的严格依赖，此种HBV持续模型同样不适合用于研究慢性乙型肝炎的形成机制或抗HBV药物的研发。本申请前期的工作开发了一种HBV慢性化小鼠模型和建立该模型所使用的HBV毒株与方法。该HBV毒株为临床分离株（GenBankNo.AF100309.1），其1.3拷贝基因组（核苷酸,nucleotide，nt955-3215/1-1950）克隆入通用质粒载体pUC18后命名为BPS；通过尾静脉高压水动力注射法将BPS注射于BALB/c或C57BL/6小鼠后，血清中能够持续检测到HBV的3个主要指标：表面抗原（HBsAg）、e抗原（HBeAg）和核酸（HBVDNA），且上述指标持续阳性时间可达33周，注射后33周时阳性率可达50%。该模型可用于HBV持续性感染机制的研究，并为抗HBV药物筛选及评估提供重要的动物模型。（专利申请号：CN201610616043.1）白介素21（Interleukin21,IL-21）首先由Parrish-Novak报道（Parrish-Novak2000），其主要由激活的CD4+细胞表达和分泌，IL-21的受体IL-21R分布于免疫细胞和非免疫细胞，当IL-21与受体结合后，通过Jak/STAT通路激活靶基因（HabibT2002）。IL-21能诱导靶细胞的分化和增值；也能够调控免疫细胞如自然杀伤细胞和细胞毒T细胞，从而破坏感染的细胞（JohnsonLD2009）或肿瘤细胞。IL-21在维持具有功能的CD8+T细胞免疫中具有重要作用。在慢性淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（lymphocyticchoriomeningitisvirus，LCMV）感染小鼠实验中，发现IL-21信号通路对于维持效应CD8+T功能是必须的，同时在IL-21基因缺陷小鼠中，CD8+T细胞数目显著下调（YiJS2009，FrohlichA2009）。在通过抗病毒治疗慢性乙肝患者过程中，血清中高含量的IL-21可以作为HBeAg血清型转换的指标（MaSW2012）。目前临床治疗慢性乙肝的药物仅限于α干扰素(interferon,IFN)和核苷（酸）类似物，其中，α干扰素（2种）具有抗病毒和免疫调节作用，以皮下注射方式给药，经α干扰素治疗后，HBeAg血清学转换率可达29%~32%，但HBsAg血清学转换率却低于10%；核苷（酸）类似物（5种）具有抑制HBV的逆转录作用，以口服方式给药，经核苷（酸）类似物治疗后血中HBV病毒载量显著下降，且有一定比例的HBeAg血清学转化，但很少出现HBsAg血清学转换；干扰素治疗存在的主要问题是患者应答率较低（仅20-30%的病人存在应答）和不良反应较大，核苷（酸）类似物治疗后易出现耐药，且无法清除肝细胞核中的cccDNA；等等。基于现有技术中的现状及存在的不足，本申请的专利技术人拟提供新的治疗药物用于控制并且最终清除HBV，具体涉及白介素21（IL-21）在制备抗乙型肝炎病毒药物中的新的用途。
技术实现思路
本专利技术的目的是基于现有技术中的现状及存在的不足，提供白介素21（IL-21）新的药用用途，具体涉及白介素21（IL-21）在制备抗乙型肝炎病毒制剂中的新的用途。本专利技术中利用小鼠模型实验验证白介素21（IL-21）可用于抗乙型肝炎病毒（HepatitisBVirus，HBV）感染。本专利技术通过以下技术方案实现：提供抗HBV用的IL-21过表达质粒pIL-21包括核酸序列NM_021782.2和质粒载体pCMV；所述的过表达质粒pIL-21，通过基因工程方法可将其中核酸序列克隆至pCMV以外的其他质粒中；所述的细胞因子IL-21表达质粒pIL-21或上述类似构建物，可通过尾静脉高压水动力方法注射入BPS小鼠模型及其他HBV动物模型中，作为抗HBV干预方式；所述的细胞因子IL-21抗HBV干预方式是通过尾静脉高压水动力方法向小鼠体内注射pIL-21质粒实现，但不限于该导入途径，例如，可将pIL-21或上述类似构建物中的IL-21基因序列插入重组病毒载体后，以重组病毒的形式导入实验动物、感染肝细胞；所述的细胞因子IL-21抗HBV干预方式是通过向小鼠体内注射携带IL-21基因的载体（质粒或病毒）实现，但不限于该导入途径，例如，可将IL-21基因在细胞系中过表达后制备纯化的蛋白，以IL-21蛋白的形式导入实验动物用于抗HBV治疗药物的应用。本专利技术中，所述pIL-21质粒的干预（注射）量为1-25μg，优选为25μg；其中，将所述pIL-21质粒1-25μg溶解于2mlPBS缓冲液中后，进行所述的干预，本专利技术的实施例中采用尾静脉高压水动力注射干预方式。本专利技术中，所述细胞因子IL-21对BPS小鼠模型抗HBV干预4周后能显著提高HBV抗原转换率，以及能显著降低血清中HBVDNA载量。本专利技术中，所述BPS小鼠模型为通过尾静脉高压水动力注射法将BPS注射于BALB/c或C57BL/6小鼠后，血清中能持续检测到HBV的3个主要指标（HBsAg、HBeAg和HBVDNA）的小鼠。本专利技术中，所述BPS质粒为HBV临床分离株（GenBankNo.AF100309.1）的1.3拷贝基因组插入通用质粒pUC18后获得。本专利技术公开了细胞因子IL-21在制备抗乙型肝炎病毒制剂中的用途，经实验证实，本专利技术所述的细胞因子IL-21在小鼠模型上具有抗HBV的干预治疗作用，试验结果显示，IL-21干预组与对照组比能显著提高HB本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.白介素21（IL‑21）在制备抗乙型肝炎病毒药物制剂中的用途 。

【技术特征摘要】
1.白介素21（IL-21）在制备抗乙型肝炎病毒药物制剂中的用途。2.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的乙型肝炎病毒为B基因型。3.白介素21（IL-21）在制备用于治疗个体中的乙型肝炎的药物中的用途。4.按权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的乙型肝炎由乙型肝炎病毒引起。5.按权利要求3所述的用途，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢幼华，刘晶，沈忠良，潘少坤，
申请(专利权)人：复旦大学，上海科垣生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31