在肺癌患者中检测EGFR基因T790M突变的试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于在肺癌患者中检测EGFR基因T790M突变的试剂盒。本发明专利技术所提供的用于在肺癌患者中检测EGFR基因T790M突变的试剂盒，含有两条单链DNA探针；所述两条单链DNA探针为单链DNA探针甲和单链DNA探针乙；所述单链DNA探针甲的序列为序列表中序列3；所述单链DNA探针乙的序列为序列表中序列4。利用本发明专利技术试剂盒在肺癌患者中检测EGFR基因T790M突变，其检测结果准确率很高，所提供的检测结果可用于辅助诊断或指导临床用药方案等。

Kit for detecting T790M mutation of EGFR gene in lung cancer patients

The invention discloses a kit for detecting T790M mutation of EGFR gene in lung cancer patients. The kit for detecting EGFR gene T790M mutation in patients with lung cancer contains two single stranded DNA probes; the two single stranded DNA probes are single stranded DNA probe A and single stranded DNA probe B; the sequence of the single stranded DNA probe A is sequence 3 in the sequence list; and the sequence of the single stranded DNA probe B is sequence in the sequence list. List 4. Using the kit of the invention, the mutation of EGFR gene T790M is detected in lung cancer patients, and the detection result has high accuracy, and the detection result can be used for auxiliary diagnosis or guiding clinical medication scheme, etc.

【技术实现步骤摘要】
在肺癌患者中检测EGFR基因T790M突变的试剂盒
本专利技术属于生物医药领域，涉及一种用于在肺癌患者中检测EGFR基因T790M突变的试剂盒。
技术介绍
癌症是全球最主要的非传染性疾病之一，也是目前致死率最高的慢性疾病，据我国《2015年中国癌症统计》，中国2015年新增429.2万例癌症病例，癌症死亡病例或超过281.4万例。其中肺癌为发病率和死亡率最高的癌种。表面生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)是重要的肺癌驱动基因，EGFR-TKIs是针对此靶点的小分子抑制剂，临床研究证实，EGFR基因热点突变的晚期非小细胞肺癌患者能从EGFR-TKI显著获益，但是超过80％的患者服用EGFR-TKI在一年内可能发展出耐药性，约50％耐药的患者具有EGFR20号外显子第790位密码子错义突变(即T790M突变)。而且阿斯利康专门针对该位点研发了新的靶向药--奥斯替尼，它是一个新型的酪氨酸激酶抑制剂类的新药，能高效、特异地抑制已经发生耐药性的晚期肺癌，并获得FDA的认证。当前依靠PCR技术的基因定量有二种方法，实时荧光定量PCR(RealTimePCR)基于Ct值，是一种相对定量的方法；数字PCR(DigitalPCR，dPCR)基于单分子PCR方法来进行计数，是一种绝对定量的方法。dPCR作为第三代PCR技术，可以不依赖任何校准物或外标而是采用直接计数目标分子，即可确定目标分子的绝对数目，是对起始样品的绝对定量。因此特别适用于依靠Ct值不能很好分辨的应用领域，如：拷贝数变异、突变检测、基因相对表达研究(如等位基因不平衡表达)、二代测序结果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等。虽然现在基因检测行业在临床上对于dPCR使用还较为谨慎，但是已经有很多研究人员将其用于DNA的定量检测，并且多项研究结果也证明dPCR技术应用在该领域的可行性。这些研究涉及肿瘤的预后评估，疗效预测及实时监控等各个方向。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于在肺癌患者中检测EGFR基因T790M突变的试剂盒。本专利技术所提供的用于在肺癌患者中检测EGFR基因T790M突变的试剂盒，含有两条单链DNA探针；所述两条单链DNA探针为单链DNA探针甲(突变探针)和单链DNA探针乙(野生探针)；所述单链DNA探针甲的序列为序列表中序列3；所述单链DNA探针乙的序列为序列表中序列4。其中，所述单链DNA探针甲和所述单链DNA探针乙的5’端均标记有荧光报告基团，3’端均标记有淬灭基团。在本专利技术中，所述单链DNA探针甲(突变探针)的5’端标记的荧光报告基团具体为FAM，3’端标记的淬灭基团具体为MGB；所述DNA探针乙(野生探针)5’端标记的荧光报告基团具体为VIC，3’端标记的淬灭基团具体为MGB。根据需要，所述试剂盒中还可含有一个引物对；所述引物对中的上游引物可根据EGFR基因T790M突变位点的上游序列进行设计；所述引物对中的下游引物可根据EGFR基因T790M突变位点的下游序列进行设计。在本专利技术中，所述引物对中的上游引物的序列具体为序列表中序列1；所述引物对中的下游引物的序列具体为序列表中序列2。所述试剂盒为基于数字PCR技术的试剂盒。在本专利技术中，采用所述试剂盒进行数字PCR时，采用的退火温度为56.0℃、58.0℃或者60.0℃。具体反应程序参见实施例。所述试剂盒在如下任一中的应用也属于本专利技术的保护范围：(A)制备用于检测肺癌患者EGFR基因是否发生T790M突变的产品；(B)制备用于检测肺癌患者服用EGFR-TKI是否会发生耐药的产品。本专利技术还保护含有所述试剂盒的如下两种产品：用于检测肺癌患者EGFR基因是否发生T790M突变的产品，用于检测肺癌患者服用EGFR-TKI是否会发生耐药的产品。在本专利技术中，所述肺癌具体为非小细胞肺癌。实验证明，利用本专利技术所提供的基于数字PCR技术用于检测肺癌EGFR基因T790M突变的试剂盒及检测方法，其检测结果准确率很高，所提供的检测结果例如可用于辅助诊断或指导临床用药方案。附图说明图1为56.0℃退火温度下，商品化T790M探针和本专利技术自合成探针的实验结果。其中，A为商品化T790M探针的实验结果；B为本专利技术自合成探针的实验结果。图2为58.0℃退火温度下，商品化T790M探针和本专利技术自合成探针的实验结果。其中，A为商品化T790M探针的实验结果；B为本专利技术自合成探针的实验结果。图3为60.0℃退火温度下，商品化T790M探针和本专利技术自合成探针的实验结果。其中，A为商品化T790M探针的实验结果；B为本专利技术自合成探针的实验结果。图1-图3中，“红”代表野生型荧光，“蓝”代表突变型荧光，“绿”代表野生型和突变型荧光同时存在，“黄”代表没有荧光。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。EGFRT790M标准品：HorizonDx公司产品，其产品目录号为HD850。其中，基因突变频率为1％；产品类型为DNA。实施例1、基于数字PCR技术用于检测肺癌EGFR基因T790M突变的引物、探针的设计与合成根据EGFR20号外显子第790位密码子错义突变(即T790M突变)，设计并合成本专利技术基于数字PCR技术用于检测肺癌EGFR基因T790M突变的引物和探针，具体序列如下：引物序列：正向引物：5’-GGCATCTGCCTCACCTCC-3’(序列1)；反向引物：5’-GACATAGTCCAGGAGGCAGC-3’(序列2)。探针序列：突变探针：5’-FAM-GAGCTGCATGATGAG-MGB-3’(序列3)；野生探针：5’-VIC-GAGCTGCGTGATGAG-MGB-3’(序列4)。实施例2、基于数字PCR技术检测肺癌EGFR基因T790M突变供试样品：EGFRT790M标准品(基因突变频率为1％)。一、实验方法1、配制反应液在0.2mlPCR管中配制PCR反应混合液：其中，两条引物和两条探针各0.5μL，两条引物和两条探针在反应体系中的终浓度均为0.3μM。QuantStudioTM3DDigitalPCRMasterMixv2为TheromFisher公司产品，其产品目录号为A26358。3、上样采用的仪器为ThermoFisher公司生产的QuantStudio3DDigitalPCRChipLoader，型号：237281048。(1)将芯片，刷头及芯片盖按步骤置于chiploader上，从上述已配制好的反应混合液中吸取14.5μL，慢慢打入刷头下部的加样孔中。(2)然后按压loading按钮(黑色长条形)，chiploader会将刷头内的反应液均匀地涂抹在芯片上，涂抹的过程中，仪器绿色指示灯闪烁，涂抹完毕后，指示灯变成常亮。(3)待刷头涂抹完毕并离开芯片后，马上取封油针悬空滴加封油约10～15滴至芯片中，要求封油正好覆盖芯片表面。(4)将chiploader臂翻转过来，使得芯片盖盖至芯片上，用手用力地按压30秒以上，然后按住臂前部的LidNest按钮，将chiploader臂抬起并放回原位。(5)将芯片取出，将芯片垂直，打开芯片盖的上半部分，会看见一本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于在肺癌患者中检测EGFR基因T790M突变的试剂盒，含有两条单链DNA探针；所述两条单链DNA探针为单链DNA探针甲和单链DNA探针乙；所述单链DNA探针甲的序列为序列表中序列3；所述单链DNA探针乙的序列为序列表中序列4。

【技术特征摘要】
1.用于在肺癌患者中检测EGFR基因T790M突变的试剂盒，含有两条单链DNA探针；所述两条单链DNA探针为单链DNA探针甲和单链DNA探针乙；所述单链DNA探针甲的序列为序列表中序列3；所述单链DNA探针乙的序列为序列表中序列4。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述单链DNA探针甲和所述单链DNA探针乙的5’端均标记有荧光报告基团，3’端均标记有淬灭基团。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述单链DNA探针甲的5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的淬灭基团为MGB；所述DNA探针乙5’端标记的荧光报告基团为VIC，3’端标记的淬灭基团为MGB。4.根据权利要求1-3中任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有一个引物对；所述引物对中的上游引物根据EGFR基因T790M突变位点的上游序列进行设计；所述引物对中的下游引物根...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵明玉，王丽丽，石太平，宋金良，刘如银，
申请(专利权)人：北京创新乐土生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11