一种前列腺癌检测探针序列及其应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，公开了一种前列腺癌检测探针序列及其应用。本发明专利技术所述探针序列包括捕获延伸探针、K型标记延伸探针和封闭探针。本发明专利技术针对前列腺癌PCA3进行捕获延伸探针、K型标记探针以及封闭探针的设计和人为优化，进一步提高了基于类似bDNA和QuantiMAT技术对前列腺癌细胞检测的特异性，表现出较佳的定量限、检测限以及灵敏度，并可应用于此类试剂盒的制备中。

A prostate cancer detection probe sequence and its application

The invention relates to the field of genetic engineering technology, and discloses a prostate cancer detection probe sequence and its application. The probe sequence of the invention comprises a capture extension probe, a K type mark extension probe and a closed probe. The invention carries out the design and artificial optimization of the capture extension probe, the K-type labeled probe and the closed probe for the prostate cancer PCA3, further improves the specificity of the prostate cancer cell detection based on the similar bDNA and QuantiMAT technology, and shows better quantitative limit, detection limit and sensitivity, and can be applied to such reagents. The preparation of the box.

【技术实现步骤摘要】
一种前列腺癌检测探针序列及其应用
本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种前列腺癌检测探针序列及其应用。
技术介绍
PCA3即新型前列腺癌抗原3，PCA3在1995年由JohnsHopkinsHospital(Baltimore)和RadboudUniversity(Nijmegen,Netherlands)合作研究发现，最初命名为DD3(differentialdisplayclone，3)因为使用差别显示分析(在那时是一种新的描述方法，用于识别不同组织中的基因表达)对比正常vs癌变前列腺组织的mRNA表达模式，发现一种mRNA在前列腺癌症中高特异性表达。PCA3在95％的检测的全部前列腺癌中过度表达，可从癌变前列腺细胞中无害测定，准确度接近100％。此外，在前列腺外组织(良性和恶性)中尚未检测到PCA3转录，证明PCA3是目前已知前列腺癌最具特异性的PCa标志物。不像血清PSA，PCA3不受年龄，前列腺体积或其他前列腺病(前列腺炎)的影响。BUSSEMAKERS等通过Northernblot法分析正常前列腺、良性前列腺增生和前列腺癌细胞及其转移灶发现，PCA3基因特异性地高表达于人类前列腺癌细胞和转移坏死灶中，在正常前列腺、良性前列腺增生细胞中不表达或低表达。且PCA3mRNA的表达水平与前列腺癌Gleason病理分级有关。相比之下，在良性和恶性前列腺疾病的患者之间，PSAmRNA水平差异无显著性。BUSSEMAKERS等还发现在正常人，除前列腺外的18种组织器官中均检测不到PCA3基因表达。HES-SELS等还对108例PSA>3ng/mL的患者行前列腺穿刺活检，用时间分辨荧光定量RT-PCR检测前列腺穿刺活检组织中的PCA3mRNA，发现PCA3mRNA在非恶性前列腺组织和良性前列腺增生组织之间差异无显著性。在前列腺癌中，癌细胞数大于10％的前列腺癌标本的PCA3mRNA拷贝数是非恶性前列腺组织的66倍。癌细胞数少于10％的前列腺癌标本的PCA3mRNA拷贝数是非恶性前列腺组织的11倍。LANDERS等用实时定量PCR检测前列腺癌组织中的PCA3mRNA表达，证实前列腺癌组织中DD3是良性前列腺增生组织的140倍。由此可见，PCA3特异性高表达于前列腺癌细胞，在正常前列腺或良性前列腺增生组织中不表达或低表达。因此PCA3适合作为前列腺癌特异性标志物。现有专利CN105861669A公开了一种快速捕获杂交靶标物分支链DNA信号放大的检测方法(QuantiMAT技术)，其灵敏度和耗时均优于bDNA技术。在其实施例中提供了检测高危型人乳头瘤病毒(HPV)16型E6E7区域的相关试验。但是不同的QuantiMAT探针序列对于前列腺癌、宫颈癌等各种癌症的特异性有着最为直接的影响，依照ProbeDesignerV1.0工具设计出的针对PCA3的QuantiMAT探针序列，在检测前列腺癌时并不能保证具备较高的特异性，致使定量限(LOQ)、检测限(LOD)以及灵敏度受到影响。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种前列腺癌检测探针序列及其应用，使得所述探针序列能够检测前列腺癌，并具备较高的特异性，可应用于前列腺癌检测相关应用中。为实现上述专利技术目的，本专利技术提供如下技术方案：一种前列腺癌检测探针序列，包括捕获延伸探针、K型标记延伸探针和封闭探针；其中，所述捕获延伸探针序列如SEQIDNo.1-14和SEQIDNo.78-85所示，所述K型标记延伸探针如SEQIDNo.15-64和SEQIDNo.86-131所示，所述封闭探针如SEQIDNo.65-77和SEQIDNo.132-148所示。针对类似于bDNA与QuantiMAT技术中相关探针在检测前列腺癌时特异性不佳的问题，本专利技术提供了一组经过人为优化后的高特异性探针，能够在定量限(LOQ)、检测限(LOD)以及灵敏度方面具备较优异的效果，同时检测信号和阳性细胞之间的线性关系也较优。由此，本专利技术提供了所述探针序列在制备检测前列腺癌试剂盒中的应用。根据上述应用，本专利技术提供了一种检测前列腺癌的试剂盒，包括本专利技术所述探针序列。更为具体地，所述试剂盒还包括信号放大前体、信号放大体、碱性磷酸酶(AP)标记的报告探针、化学发光底物以及偶联有通用探针的载体中的一种或两种以上；其中，所述通用探针与本专利技术所述捕获延伸探针的部分序列互补配对；所述信号放大前体包括放大前体前置引导区序列和多次重复的放大体前置引导区互补序列；所述信号放大体包括放大体前置引导区序列和多次重复的报告探针互补序列；所述放大前体前置引导区序列与本专利技术所述K型标记延伸探针部分序列互补配对；所述放大体前置引导区序列与所述多次重复的放大体前置引导区互补序列互补配对；所述碱性磷酸酶标记的报告探针与所述多次重复的报告探针重复区互补序列互补配对。根据本领域经常使用的各种载体形式，本专利技术所述载体优选为磁珠或细胞培养板，通用探针可通过一些修饰，比如氨基修饰既可以与磁珠表面的基团相偶联，也可通过包被液包被在细胞培养板上。在本专利技术具体实施方式中，本专利技术提供了一种具体的通用探针，其序列如SEQIDNo.149所示。在发光底物的选择中，本专利技术选择金刚烷衍生物作为AP报告探针的发光底物，用于化学发光分析仪检测。本专利技术所述信号放大前体、信号放大体、碱性磷酸酶(AP)标记的报告探针可对应参考专利CN105861669A中公开的初级信号放大链、次级信号放大链和AP偶联的报告探针中的描述或具体的序列设计。作为优选，本专利技术所述多次重复为20次重复。作为优选，所述通用探针与本专利技术所述捕获延伸探针的部分序列互补配对，其中所述部分序列为本专利技术所述捕获延伸探针的3’端至5’方向的16bp序列；在本专利技术具体实施方式中，所有末端16bp序列为CTCTTGGAAAGAAAGT的探针都属于捕获延伸探针，其能够和SEQIDNo.149所示的通用探针互补配对结合。作为优选，所述放大前体前置引导区序列与本专利技术所述K型标记延伸探针部分序列互补配对，其中所述部分序列为本专利技术所述K型标记延伸探针的3’端至5’方向的14bp序列；在本专利技术具体实施方式中，所有末端14bp序列为ctgagtcaaagcat或gaagttaccgtttt的探针都属于K型标记延伸探针，其能够和所述放大前体前置引导区序列互补配对结合，由此也可以设计出所述放大前体前置引导区序列。通过ProbeDesignerV1.0工具(http://www.probedesigner.cn/)设计出一套针对前列腺癌PCA3的QuantiMAT探针序列作为对照，为保证可对比性，对照探针中所有末端16bp序列为CTCTTGGAAAGAAAGT的探针都属于捕获延伸探针(CE)，所有末端14bp序列为ctgagtcaaagcat或gaagttaccgtttt的探针都属于K型标记延伸探针(LE)，其余为封闭探针(BL)，具体如下：捕获延伸探针：p0-CE：AGGGCACTCTTGTGAGCCACtttttCTCTTGGAAAGAAAGT；p640-CE：AAGAACTCTGAGTGATATCAACATTAGGtttttCTCTTGGAAAGAAAGT；p701-CE：GGTCAAAAGGAACC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种前列腺癌检测探针序列，其特征在于，包括捕获延伸探针、K型标记延伸探针和封闭探针；其中，所述捕获延伸探针序列如SEQ ID No.1‑14和SEQ ID No.78‑85所示，所述K型标记延伸探针如SEQ ID No.15‑64和SEQ ID No.86‑131所示，所述封闭探针如SEQ ID No.65‑77和SEQ ID No.132‑148所示。

【技术特征摘要】
1.一种前列腺癌检测探针序列，其特征在于，包括捕获延伸探针、K型标记延伸探针和封闭探针；其中，所述捕获延伸探针序列如SEQIDNo.1-14和SEQIDNo.78-85所示，所述K型标记延伸探针如SEQIDNo.15-64和SEQIDNo.86-131所示，所述封闭探针如SEQIDNo.65-77和SEQIDNo.132-148所示。2.权利要求1所述探针序列在制备检测前列腺癌试剂盒中的应用。3.一种检测前列腺癌的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述探针序列。4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，还包括信号放大前体、信号放大体、碱性磷酸酶(AP)标记的报告探针、化学发光底物以及偶联有通用探针的载体中的一种或两种以上；其中，所述通用探针与权利要求1中所述捕获延伸探针的部分序列互补配对；所述信号放大前体包括放大前体前置引导区序列和多次重复的放大体前置引导区互补序列；所述信号放大体包括放大体前置引导区序列和多次重复的报告探针互补序列；所述放大前体前置引导区序列与权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：张鹭鹭，张惠箴，黄谨，李先坤，田小强，徐文茹，李鑫，李小磊，孟歌，何丽，韩燃，郭曙光，苏芹，
申请(专利权)人：郑州科蒂亚生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：河南,41