本发明专利技术公开了一种非小细胞肺癌检测中高表达的UCR序列、试剂盒及检测方法。本发明专利技术在系统探索非小细胞肺癌的UCR表达谱后，发现与非小细胞肺癌侵袭转移特异性相关的一组UCRs，结果筛选到一条在非小细胞肺癌组织中显著高表达的UCR，即uc.293‑。本发明专利技术通过检测非小细胞肺癌特异性相关的超保守基因序列293号，为肿瘤诊断、预后判断及治疗提供帮助。
A highly specific UCR sequence, detection kit and detection method in non-small cell lung cancer
The invention discloses a UCR sequence, a kit and a detection method for high expression in the detection of non-small cell lung cancer. After systematically exploring the UCR expression profiles of non-small cell lung cancer, a group of UCRs related to the specificity of invasion and metastasis of non-small cell lung cancer were found, and a UCR with significantly high expression in non-small cell lung cancer was screened, namely uc. 293. The invention provides help for tumor diagnosis, prognosis judgment and treatment by detecting the superconserved gene sequence 293 specifically related to non-small cell lung cancer.
【技术实现步骤摘要】
在非小细胞肺癌中一种特异性高表达的UCR序列、检测试剂盒及检测方法
本专利技术属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及一种检测在非小细胞组织中高表达的UCR序列、试剂盒及检测方法。
技术介绍
非小细胞肺癌是我国常见的恶性肿瘤，发病率与死亡率位于肿瘤前列。根据临床病理特点分为非小细胞肺癌和小细胞肺癌，其中非小细胞肺癌约占所有肺癌的80％，大多数患者发现时已处于中晚期，5年生存率只有16％。非小细胞肺癌患者治疗失败的原因主要与能否早期诊断及肺癌细胞侵袭转移和复发密切有关,是非小细胞肺癌治疗失败和患者死亡的主要原因。uc.293-是超保守基因序列(UCRs)的一员，是一类在生物进化中绝对高度保守的长链非编码RNA(LncRNA)，其基因序列在、小鼠和大鼠等高等生物中保持高度同源性。研究表明转录成RNA的UCRs发挥其特有的生物学功能，即通过调节其他RNA从而调控功能基因的表达，参与肿瘤细胞的生长发育、细胞凋亡、细胞周期及侵袭转移等生物学过程，目前正在成为肿瘤诊治和研究的新热点。截至今日己有较多的UCRs被证实在包括膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌及炎症性肠病等在内的类疾病中存在差异性表达并执行重要的调控功能。但关于非小细胞肺癌中的UCR表达及其相关指标的功能性的研究目前还未见文献报道。
技术实现思路
鉴于上述技术问题，本专利技术提供一种非小细胞肺癌检测中高表达的UCR序列、试剂盒及方法。解决上述技术问题的技术方案是：为了系统研究与非小细胞肺癌发生与发展密切相关的新的UCRs，由专利技术提供的20个非小细胞肺癌和配对的15个正常组织标本，取得新鲜标本后冻存与液氮罐中，集齐后采用上海康成生物有限公司的ArraystarHumanT-UCR芯片2.0检测筛选出二条在非小细胞肺癌组织中高表达的UCR，其中uc.293-显著高表达。其基因序列如序列表SEQIDNO.1所示。后期经过共132对非小细胞肺癌与配对正常组织样本qRT-PCR验证发现106对样本中该UCR表达显著上调。该UCR有望成为非小细胞肺癌诊断和预后判断的标志物，同时也为非小细胞肺癌的治疗提供了新的靶点。本专利技术的目的是提供一种检测在非小细胞肺癌组织中高表达的uc.293-序列，具有如序列表中SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。本专利技术还提供了所述uc.293-序列的检测方法，根据该序列制备用于非小细胞肺癌辅助诊断或者疗效预测的制剂。即探索其在制备非小细胞肺癌的药物中的应用。本专利技术根据所述uc.293-序列设计了3对引物用于检测uc.293-序列。Pair1上游引物：SEQIDNO.2Pair1下游引物：SEQIDNO.3Pair2上游引物：SEQIDNO.4Pair2下游引物：SEQIDNO.5Pair3上游引物：SEQIDNO.6Pair3下游引物：SEQIDNO.7。本专利技术根据所述uc.293-序列设计并合成出用于qRT-PCR的检测引物组。所述引物组适用于SYBRGreen、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、复合探针等进行检测。优选的用于染料类qRT-PCR检测的引物组分别为：Pair2上游引物：SEQIDNO.4Pair2下游引物：SEQIDNO.5。本专利技术提供了一种检测UCR表达水平的染料类qRT-PCR试剂盒，组分如下：特异性上游引物引物序列、特异性下游引物引物序列、DNA模板、荧光染料、qRT-PCR反应液，其中所述的特异性上游引物和下游引物包括SEQIDNO.4和SEQIDNO.5。所述qRT-PCR反应液包括buffer缓冲液、Taq酶、Mg2+及dNTP。对于荧光染料优选SYBRGreenⅡ，Taq酶优选热启动酶。本专利技术还公开了一种非小细胞肺癌中UCR的检测方法，包括样品总RNA的提取、样品cDNA的制备、uc.293-的扩增。具体内容如下：1)样品总RNA的提取：按照ThermoFisherScientific公司的TRIZOL⑧试剂(货号15596018)所需试剂及步骤提取非小细胞肺癌组织或肿瘤的总RNA；再用NanoDropND1000微量紫外可见分光光度计定量(NanoDropTechnologies,Wilmington,Delaware)定量所提取的RNA的纯度和浓度。2)样品cDNA的制备：采用TaKaRa试剂盒PrimeScriptFirstStrandcDNAsynthesis(货号6110A)对提取的总RNA反转录合成cDNA。反应体系及条件如下：试剂使用量TemplateRNA/PrimerMixture2.0μlTotalRNA1.0μgRNaseFreedH20Upto20μl总体积20μl将上述组份混合均匀后37℃15分钟后85℃5秒，即得到cDNA。3)uc.293-的扩增：使用Takara公司的PrimeScriptTMRTMasterMix试剂盒进行实时荧光定量PCR。以反转录的cDNA为模板进行qRT-PCR扩增。反应体系及条件如下：qRT-PCR程序：95℃30s预变性，接40个循环：95℃5s,60℃45s。通过对阳性样品的检测，发现本专利技术染料类荧光定量试剂盒检测准确率均在82％-87％以上，连续10次重复实验，实验结果稳定。本专利技术还针对uc.293-序列设计并合成其特异性RNA干扰序列：siRNA1(SEQIDNO.8)、siRNA2(SEQIDNO.9)，所述干扰序列能显著敲低肿瘤细胞中uc.293-的表达水平(图8)，并且可导致肿瘤细胞的侵袭能力较之前明显减弱(图9)。本专利技术的有益效果：1、为系统探索非小细胞肺癌的UCR表达谱后，发现与非小细胞肺癌发生发展特异性相关的一组UCRs，本专利技术采用长链非编码RNA-UCR芯片技术筛选到一条在非小细胞肺癌组织中显著高表达的UCRs，比对UCR基因组数据库发现uc.293-位于于类染色体10号染色体反义链102,505,468-102,589,698碱基之间，基因全长约为84230。2、与配对正常组织相比，该UCRs在非小细胞肺癌组织中显著高表达，并在后期的大样本组织实时qRT-PCR实验中进一步证实uc.293-在非小细胞肺癌组织中的表达，显著高于配对正常组织。3、本专利技术涉及的检测uc.293-表达水平的qRT-PCR试剂盒。该qRT-PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，灵敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。4、本专利技术重点关注了非小细胞肺癌组织的UCR表达谱，这一类新型的基因调控因子将有望进一步丰富和完善包括非小细胞肺癌在内的肿瘤发病机制的研究，也为发现肿瘤诊断及预后判断的标志物、新的肿瘤治疗靶点带来希望。附图说明图1.UCR芯片图示显示uc.293-在3例非小细胞肺癌组织中表达升高(对照组为3例)，差异表达倍数达到近6倍，浅色代表表达下降，深色代表表达升高；图1A，结果显示：在3例非小细胞肺癌组织和3例癌旁正常肺组织中，LncRNA和mRNA的表达谱截然不同，绿色代表表达下降，红色代表表达升高(图1)；图1B，LncRNA(UCRs)芯片结果原始数据显示uc.283、uc.293-在3例非小细胞肺癌组织中表达上调；其中uc.293-差异表达倍数达5.71倍。图2.特异性引物筛选结果图针对uc.293-的序列设计的3对本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.在非小细胞肺癌中一种特异性高表达的UCR序列，其特征在于，所述UCR序列具有如序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
1.在非小细胞肺癌中一种特异性高表达的UCR序列，其特征在于，所述UCR序列具有如序列表中SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。2.一种检测UCR表达水平的染料类qRT-PCR检测试剂盒，其特征在于，包括根据核苷酸序列为SEQIDNO.1的长链非编码RNA设计并合成出特异性用于qRT-PCR检测的特异性上游引物和下游引物。3.根据权利要求2所述的检测UCR表达水平的染料类qRT-PCR检测试剂盒，其特征在于，用于qRT-PCR检测的特异性引物包括3对，分别为：Pair1上游引物：SEQIDNO.2Pair1下游引物：SEQIDNO.3Pair2上游引物：SEQIDNO.4Pair2下游引物：SEQIDNO.5Pair3上游引物：SEQIDNO.6Pair3下游引物：SEQIDNO.7。4.根据权利要求3所述的检测UCR表达水平的染料类qRT-PCR检测试剂盒，其特征在于，用于qRT-PCR检测的特异性引物为序列表SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示。5.根据权利要求2所述的检测UCR表达水平的染料类qRT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括DNA模板、荧光染料、qRT-PCR反应液，所述qRT-PCR反应液包括buffer缓冲液、Taq酶、...
【专利技术属性】
技术研发人员：周俊，
申请(专利权)人：扬州大学附属医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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