PRRSV N蛋白的原核可溶性表达方法技术

本发明专利技术公开了一种PRRSV N蛋白的原核可溶性表达方法及间接ELISA抗体检测方法，PRRSV N蛋白的原核可溶性表达方法包括(1)根据大肠杆菌密码子偏嗜性特征，人工优化并合成PRRSV N蛋白编码基因；(2)以MBP作为促溶标签，构建N蛋白原核表达载体；(3)MBP融合N蛋白表达与纯化；再通过间接ELISA抗体检测方法进行特异性试验。本发明专利技术以带有MBP标签的PMAL‑C4X作为表达载体，实现了PRRSV N蛋白在大肠杆菌中的高效可溶性表达，诱导培养在接近室温进行，无需加热或降温设备，目的蛋白洗脱采用10mmoL/L麦芽糖溶液，洗脱效果好，用量少，节约成本。本发明专利技术以融合N蛋白为包被抗原建立的间接ELISA抗体检测方法特异性强；本发明专利技术建立间接ELISA抗体检测方法与IDEXX同类试剂盒的总符合率为90％左右。

Prokaryotic expression method of PRRSV N protein and indirect ELISA antibody detection method

The invention discloses a prokaryotic soluble expression method of PRRSV N protein and an indirect ELISA antibody detection method. The prokaryotic soluble expression method of PRRSV N protein includes: (1) Artificially optimizing and synthesizing the PRRSV N protein coding gene according to the codon preference characteristics of E. Nuclear expression vector; (3) MBP fusion N protein expression and purification; then through indirect ELISA antibody detection method for specificity test. The method uses PMAL_C4X with MBP tag as expression vector, realizes high soluble expression of PRRSV N protein in E. coli, induces culture at near room temperature, and does not need heating or cooling equipment. The indirect ELISA antibody detection method based on fusion N protein as coating antigen has strong specificity, and the total coincidence rate between the indirect ELISA antibody detection method and IDEXX similar kit is about 90%.

【技术实现步骤摘要】
PRRSVN蛋白的原核可溶性表达方法及间接ELISA抗体检测方法
本专利技术属于分子生物学
，尤其涉及一种PRRSVN蛋白的原核可溶性表达方法及间接ELISA抗体检测方法。
技术介绍
猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSvirus，PRRSV)引起的一种高度接触性传染病，其能引起母猪繁殖障碍及育肥猪呼吸系统疾病，并伴有轻度神经症状，严重时可造成全身病毒血症。近年来，由于基因重组导致不断有新毒株(例如NADC30，NADC30-like)出现，使得对PRRS防控的难度增加。根据病毒基因特征和全球范围内流行状况可将PRRSV分为1型(欧洲型)和2型(美洲型)，在我国主要流行的是2型，PRRSV基因组长15.2Kb，含有10个开放阅读框(OpenReadingFrame,ORF)，分别为ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5、ORF5a、ORF6和ORF7，相邻开放阅读框之间存在短的重叠序列。其中由ORF7编码的核衣壳蛋白N占病毒总蛋白的20-40％，具有强免疫原性，在PRRSV感染猪一周左右即可刺激机体产生特异性抗体，并持续数月之久。所以，N蛋白在PRRSV的流行病学监测和诊断等方面具有重要意义。由于操作相对简便和制备成本低廉，使得大肠杆菌成为体外表达外源基因的首选系统，但表达的外源蛋白大都是以非可溶性的包涵体形式存在，与天然活性蛋白差距甚远，限制了其应用。目前，原核表达系统中常用的促溶标签有谷胱甘肽S转移酶(GTS)、麦芽糖结合蛋白(MBP)和硫氧还蛋白。其中MBP是大肠杆菌K12的malE基因编码蛋白，分子量42kDa，研究表明其可以行使分子伴侣的作用，提升蛋白正确折叠率，对难以表达的膜蛋白和某些病毒蛋白都具有很好的促溶作用。此外，MBP能与直链淀粉树脂发生特异性结合，利用麦芽糖竞争性抑制原理可以分离MBP融合蛋白，采用FactorXa将MBP标签切除即可获得纯的目的蛋白。虽然MBP标签分子量比较大，但研究表明，MBP表达并不影响目的蛋白生物学性质。PRRSVN蛋白是一种碱性蛋白，局部亲水性较好，通过调整表达条件和添加促溶标签等方式可以实现大肠杆菌的可溶性表达。目前采用MBP作为促溶标签实现N蛋白的原核高效可溶性表达尚鲜有报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种PRRSVN蛋白的原核可溶性表达方法及间接ELISA抗体检测方法，旨在解决上述
技术介绍
中提出的问题。本专利技术是这样实现的，一种PRRSVN蛋白的原核可溶性表达方法，包括如下步骤：(1)根据大肠杆菌密码子偏嗜性特征，人工优化并合成PRRSVN蛋白编码基因，所述PRRSVN蛋白编码基因序列如SEQIDNO.1所示；(2)以MBP作为促溶标签，构建N蛋白原核表达载体设计PCR引物，对所述合成的PRRSVN蛋白编码基因进行PCR扩增，所述引物序列如下：上游引物为F：5'-CGGAATTCATGCCAAATAACAACGGCAAG-3'，下划线为EcoRⅠ酶切位点；下游引物为R：5'-AACTGCAGTCATGCTGAGGGTGATGCTGTG-3'，下划线为PstⅠ酶切位点；PCR扩增反应体系为：按体积百分含量计，Ex-Taq预混酶50％、上游引物和下游引物各3％、模板2％、余量为蒸馏水；利用EcoRⅠ和PstⅠ分别双酶切PCR产物和带有MBP标签的PMAL-C4X载体，反应体系为：按体积百分含量计，胶回收产物12.5％，线性化后PMAL-C4X载体50％，10xBufferH10％，EcoRⅠ5％，PstⅠ5％，余量为ddH2O；筛选阳性重组质粒；(3)MBP融合N蛋白表达与纯化将(2)中筛选的阳性重组质粒转入培养液中诱导表达；再进行裂解、离心，将直链淀粉树脂加入到层析柱中，用缓冲液洗涤树脂，然后将离心收集的上清液加入到层析柱中进行分离纯化，最后加入麦芽糖溶液洗脱目的蛋白，将麦芽糖用PBS置换。优选地，步骤(2)中，所述上游引物和下游引物的浓度各为20μM。优选地，步骤(3)中，所述诱导表达采用IPTG作为诱导剂。优选地，步骤(3)中，所述诱导表达时诱导温度为22-28℃，诱导时间为10-12h。优选地，步骤(3)中，所述麦芽糖溶液的浓度为10mmoL/L。本专利技术进一步提供了一种PRRSV间接ELISA抗体检测方法，该方法包括以下步骤：包被抗原：将纯化后的MBP融合N蛋白以碳酸盐缓冲液稀释后加入ELISA板中，4℃包被过夜；洗涤：弃去包被液并用PBST洗三遍；封闭：每孔加入150μL5％PBST，37℃封闭2小时，弃去封闭液并洗涤三遍；孵育一抗：以一定的血清稀释度将猪血清与血清稀释液混匀，150μL/孔，37℃孵育1小时，弃去并洗涤三遍；孵育二抗：加入PBST稀释的HRP标记的抗猪IgG抗体，100μl/孔，37℃孵育40分钟，弃去并洗涤五遍；显色与读值：以100μL/孔加入TMB底物溶液，室温反应10min后加入1.25M硫酸终止液，酶标仪读取OD450nm吸收值。优选地，所述血清稀释度1：200。优选地，所述抗原包被浓度为1μg/mL。相比于现有技术的缺点和不足，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术以带有MBP标签的PMAL-C4X作为表达载体，实现了PRRSVN蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达，融合N蛋白能被抗MBP的单抗和PRRSVN蛋白兔多抗特异识别。本专利技术以融合N蛋白为包被抗原建立的间接ELISA抗体检测方法不与猪圆环病毒2型(PCV2)、古典猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)等猪血清发生交叉反应。田间样品检测结果表明，本专利技术建立间接ELISA抗体检测方法与IDEXX同类试剂盒的总符合率为90％左右。本专利技术以MBP作为促溶标签，实现了PRRSVN蛋白在大肠杆菌内的高效可溶性表达，诱导表达时采用接近室温22-28℃进行，无需加热或降温设备，目的蛋白洗脱时采用低浓度麦芽糖溶液，其浓度仅为10mmoL/L，需求量少，节约成本；重组蛋白具有良好的免疫反应性，这为深入研究N蛋白功能以及开发PRRS相关诊断制剂奠定了基础。附图说明图1是本专利技术实施例提供的PRRSVQH08毒株ORF7基因的PCR扩增结果图；图中：M-DL2000DNA分子质量标准；1-PRRSVQH08毒株ORF7基因PCR扩增产物。图2是本专利技术实施例提供的PMAL-C4X-PRRSV-MBP-ORF7重组质粒的双酶切鉴定结果图；图中：M-DL2000DNA分子质量标准；1-未酶切PMAL-C4X-PRRSV-MBP-ORF7重组质粒；2-EcoRⅠ和PstⅠ双酶切PMAL-C4X-PRRSV-MBP-ORF7重组质粒。图3是本专利技术实施例提供的PRRSVQH08MBP重组N蛋白SDS-PAGE检测结果图；图中：M-蛋白分子质量标准；1-PMAL-C4X-PRRSV-MBP-ORF7BL21(DE3)宿主菌诱导后超声破碎菌体上清液；2-PMAL-C4X-PRRSV-MBP-ORF7BL21(DE3)宿主菌诱导前菌体上清液；3-直链淀粉树脂吸附MBP融合N蛋白后流穿液；4-直链淀粉树脂洗脱下的MBP融合本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种PRRSV N蛋白的原核可溶性表达方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)根据大肠杆菌密码子偏嗜性特征，人工优化并合成PRRSV N蛋白编码基因，所述PRRSV N蛋白编码基因序列如SEQ ID NO.1所示；(2)以MBP作为促溶标签，构建N蛋白原核表达载体设计PCR引物，对所述合成的PRRSV N蛋白编码基因进行PCR扩增，所述引物序列如下：上游引物为F：5'‑CGGAATTCATGCCAAATAACAACGGCAAG‑3'，下划线为EcoRⅠ酶切位点；下游引物为R：5'‑AACTGCAGTCATGCTGAGGGTGATGCTGTG‑3'，下划线为PstⅠ酶切位点；PCR扩增反应体系为：按体积百分含量计，Ex‑Taq预混酶50％、上游引物和下游引物各3％、模板2％、余量为蒸馏水；利用EcoRⅠ和PstⅠ分别双酶切PCR产物和带有MBP标签的PMAL‑C4X载体，反应体系为：按体积百分含量计，胶回收产物12.5％，线性化后PMAL‑C4X载体50％，10x Buffer H 10％，EcoRⅠ5％，PstⅠ5％，余量为ddH2O；筛选阳性重组质粒；(3)MBP融合N蛋白表达与纯化将(2)中筛选的阳性重组质粒转入培养液中诱导表达；再进行裂解、离心，将直链淀粉树脂加入到层析柱中，用缓冲液洗涤树脂，然后将离心收集的上清液加入到层析柱中进行分离纯化，最后加入麦芽糖溶液洗脱目的蛋白，将麦芽糖用PBS置换。...

【技术特征摘要】
1.一种PRRSVN蛋白的原核可溶性表达方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)根据大肠杆菌密码子偏嗜性特征，人工优化并合成PRRSVN蛋白编码基因，所述PRRSVN蛋白编码基因序列如SEQIDNO.1所示；(2)以MBP作为促溶标签，构建N蛋白原核表达载体设计PCR引物，对所述合成的PRRSVN蛋白编码基因进行PCR扩增，所述引物序列如下：上游引物为F：5'-CGGAATTCATGCCAAATAACAACGGCAAG-3'，下划线为EcoRⅠ酶切位点；下游引物为R：5'-AACTGCAGTCATGCTGAGGGTGATGCTGTG-3'，下划线为PstⅠ酶切位点；PCR扩增反应体系为：按体积百分含量计，Ex-Taq预混酶50％、上游引物和下游引物各3％、模板2％、余量为蒸馏水；利用EcoRⅠ和PstⅠ分别双酶切PCR产物和带有MBP标签的PMAL-C4X载体，反应体系为：按体积百分含量计，胶回收产物12.5％，线性化后PMAL-C4X载体50％，10xBufferH10％，EcoRⅠ5％，PstⅠ5％，余量为ddH2O；筛选阳性重组质粒；(3)MBP融合N蛋白表达与纯化将(2)中筛选的阳性重组质粒转入培养液中诱导表达；再进行裂解、离心，将直链淀粉树脂加入到层析柱中，用缓冲液洗涤树脂，然后将离心收集的上清液加入到层析柱中进行分离纯化，最后加入麦芽糖溶液洗脱目的蛋白，将麦芽糖用PBS置换。2.如权利要求1所述的PRRSVN蛋白的原核可溶性表达方法，其特征在于，步骤(2)中，所述上游引物和下游引物的...

【专利技术属性】
技术研发人员：张杰，张永光，丁耀忠，刘永生，代军飞，王俊，马炳，欧云文，孙跃峰，吕建亮，邵军军，周鹏，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃,62