一种人乙型脑炎病毒抗体固相竞争ELISA检测试剂盒及其制备方法和检测方法技术

本发明专利技术涉及一种医学检测用试剂盒，确切讲本发明专利技术是一种用于人乙型脑炎病毒抗体固相竞争ELISA检测试剂盒及其制备方法和检测方法。所述试剂盒包含有包被人乙型脑炎病毒灭活抗原的ELISA板，人乙型脑炎病毒的阳性血清、猴抗人乙型脑炎病毒的阳性对照血清和人阴性对照血清。采用本发明专利技术的试剂盒进行检测，可不分人种的检测感染人乙型脑炎病毒的患者血清，不仅可以高通量的检测临床患者血清样品，还可根据需要检测样品的抗体效价。同时，所提供的固相竞争ELISA试剂盒操作简单，易于掌握；不需高端仪器设备，易于推广；成本低，适于临床血清样品检测及实验室研究应用。

Solid phase competitive ELISA detection kit for human encephalitis virus antibody and preparation method and detection method thereof

The invention relates to a kit for medical detection, in particular to a solid-phase competitive ELISA kit for detection of human encephalitis B virus antibody, a preparation method and a detection method thereof. The kit comprises an ELISA plate encapsulated with an inactivated antigen of human encephalitis B virus, a positive serum of human encephalitis B virus, a positive control serum of monkeys against human encephalitis B virus and a negative control serum of human beings. The kit can detect the serum of patients infected with human encephalitis B virus regardless of race. It can not only detect the serum samples of clinical patients with high throughput, but also detect the antibody titer of the samples according to the need. At the same time, the solid-phase competitive ELISA kit is easy to operate and master, does not need high-end equipment, easy to promote, low cost, suitable for clinical serum sample detection and laboratory research applications.

【技术实现步骤摘要】
一种人乙型脑炎病毒抗体固相竞争ELISA检测试剂盒及其制备方法和检测方法
本专利技术涉及一种医学检测用试剂盒，确切讲本专利技术是一种用于人乙型脑炎病毒抗体固相竞争ELISA检测试剂盒及其制备方法和检测方法。
技术介绍
人乙型脑炎病毒简称乙脑病毒，属于虫媒病毒黄病毒科黄病毒属。感染患者主要症状为持续高热、头痛、呕吐、昏睡、痉挛等。其中重症者可周身高烧、抽痉不止、脑水肿、呼吸或循环衰竭而死亡，部分患者愈后会留有后遗症。消除蚊虫聚集地，扑灭越冬蚊和新生成蚊是预防乙脑的关键。人体接种疫苗可提高对乙脑病毒感染的抵抗力，对预防乙脑也有良好效果。乙脑尚无特效治疗方法。早期及时诊疗，中西医结合处理，可大大提高治愈率，减少后遗症发生概率。1935日本学者首先从因脑炎死亡病人的脑组织中分离到该病毒，故国际上又称日本脑炎病毒(Japaneseencephalitisvirus,JEV)，所致疾病在日本称日本乙型脑炎(JBE)。1950年以来，中国对该病进行了大量病原学和流行病学研究，为了与甲型脑炎相区别，定名为流行性乙型脑炎，简称乙脑，是中国夏秋季流行的主要传染病之一，除新疆、西藏、青海外，全国各地均有病例发生，年发病人数2.5万，病死率10％，大约15％的患者留有不同程度的后遗症。目前已报道的病原学检测技术主要有病毒分离、RT-PCR、巢式PCR、RT-LAMP、SYBRGreenRT-PCR、TaqmanRT-PCR和MGBRT-PCR等。病毒分离不仅对试验环境要求高，所需时间长。RT-PCR、巢式PCR和RT-LAMP需对后续结果进行处理，容易出现交叉污染及假阳性结果。SYBRGreenRT-PCR、TaqmanRT-PCR和MGBRT-PCR在对引物和探针设计时，不仅对基因序列要求高，而且费用高，需要高端仪器，上述检测方法需要对操作人员进行严格培训后方能工作。而用于该病抗体检测的ELISA方法操作简单，容易掌握，不需要高端精密的仪器设备，易于推广。目前针对人乙型脑炎病毒抗体检测的ELISA方法多为间接ELISA，此法只能针对特定的乙脑血清样品，且只能判断血清样品的阴阳性，没有检测抗体效价的标准，因此无法检测被检样品的抗体效价，也无法根据此结果判断感染或者所处感染时期及免疫接种后恢复情况。
技术实现思路
本专利技术的技术任务在于提供一种可克服现有技术不足，具有特异、敏感、快速、方便、廉价特点的用于检测人乙型脑炎病毒抗体的检测试剂盒；本专利技术的另一目的在于提供一种该检测试剂盒的制备方法和检测方法。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种人乙型脑炎病毒抗体固相竞争ELISA检测试剂盒，所述试剂盒内包含有包被人乙型脑炎病毒灭活抗原的ELISA板、猴抗人乙型脑炎病毒的阳性血清、人乙型脑炎病毒的阳性对照血清和人阴性对照血清。优选地，所述ELISA板上包被的人乙型脑炎病毒灭活抗原是通过细胞传代培养获得的。优选地，所述试剂盒内还含有用于洗涤和血清稀释的PBST溶液、TMBA液、TMBB液和终止液。制备所述的一种人乙型脑炎病毒抗体固相竞争ELISA检测试剂盒的方法，包括以下步骤：(1)通过细胞传代培养获得人乙型脑炎病毒灭活抗原；(2)取步骤(1)获得的人乙型脑炎病毒灭活抗原加入ELISA板中，4℃过夜；甩干ELISA板，再用PBST溶液洗3～5遍；用BSA在37℃下封闭1小时，制成包被人乙型脑炎病毒灭活抗原的ELISA板；(3)制备猴抗人乙型脑炎病毒的阳性血清，添加到试剂盒中；(4)将人乙型脑炎病毒的阳性对照血清、人阴性对照血清、PBST溶液、TMBA液、TMBB液和终止液添加到试剂盒中。优选地，步骤(1)所述获得人乙型脑炎病毒灭活抗原包括以下步骤：待Vero细胞生长密度达80～85％时，取-80℃保存的105TCID50的人乙型脑炎病毒，冰上融化后用OPTI-MEM做5倍稀释，取2.5mL感染75cm2细胞瓶中细胞，37℃孵育1小时，期间每15分钟轻轻晃动2-3次，之后弃掉病毒感染液，再加入10mLOPTI-MEM，最后置于37℃、5％CO2的恒温培养箱中培养，待细胞发生病变，病变细胞漂浮后将细胞瓶置于-80℃，反复冻融3次，之后于4℃、8000rpm的条件下离心30分钟去除细胞碎片，再将上清于4℃、35000rpm的条件下离心3小时，弃上清，用适量的PBS溶液悬浮沉淀，收集的病毒用体积比为2‰的甲醛溶液37℃过夜灭活。优选地，步骤(2)所述抗原的浓度为10ng/μL，添加量为50μL/孔。优选地，步骤(2)所述PBST的添加量为100μL/孔。优选地，步骤(2)所述BSA的质量体积浓度为2％，添加量为100μL/孔。优选地，步骤(3)所述猴抗人乙型脑炎病毒的阳性血清的制备包括以下步骤：选择20～25kg的健康公猴，将超离纯化的人乙型脑炎病毒与等体积的完全弗氏佐剂乳化，背部皮下多点注射免疫，免疫剂量为3mg/只；一免后15天，人乙型脑炎病毒与等体积的不完全弗氏佐剂乳化，皮下多点注射免疫猴子，免疫剂量为3mg/只；二免后15天，人乙型脑炎病毒与等体积的不完全弗氏佐剂乳化，皮下多点注射加强免疫猴子，免疫剂量为1mg/只；三免后7天，耳缘静脉采血，用ELISA法测血清抗体效价为1：128以上时，上肢静脉采血，分离血清，分装后-80℃保存。一种利用所述的人乙型脑炎病毒抗体固相竞争ELISA检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：(1)将待检血清和猴竞争血清进行适当比例稀释，向包被人乙型脑炎病毒灭活抗原的ELISA板中分别加入50μL/孔，37℃下孵育1小时；(2)甩干ELISA板，每孔加200μLPBST溶液洗4遍；(3)将抗猴IgG酶标二抗进行适当比例稀释，向步骤(2)的ELISA板中分别加入50μL/孔，37℃下孵育1小时；(4)甩干ELISA板，每孔加100μLPBST溶液洗4遍；(5)将TMBA液和B液以体积比1:1混合均匀，每孔50μL加入步骤(4)的ELISA板中，室温下孵育20min；(6)每孔50μL终止液加入步骤(5)的ELISA板中，选择450nm波长读值。优选地，步骤(1)所述的猴竞争血清的稀释比例为1:1000；待测血清的稀释比例为，当检测抗体效价时是从1:4开始2倍比稀释，当高通量检测血清样品时是1:16稀释。优选地，步骤(3)所述的抗猴IgG酶标二抗的稀释比例为1:3000。本专利技术的有益效果在于：1)采用本专利技术的试剂盒进行检测可消除人或动物种属差异，即只用抗猴的二抗就可检测不同种属来源的疑似人乙型脑炎病毒感染的血清样品；2)成本低，操作简便；3)不仅可高通量检测样品，还可根据实验要求检测血清的抗体效价；4)本专利技术用于包被的病毒系是通过细胞传代培养的，细胞培养比采用鸡胚培养有如下优点：操作简单、成本低廉、耗时短及易于纯化。本研究建立的固相竞争ELISA检测方法(OIE指定的检测血清抗体效价的方法，有口蹄疫竞争ELISA为例)，不仅可以消除血清样品的种属来源差异(用一种HRP标记的二抗，可检测人、猴、猩猩等灵长类等来源的血清样品)，还可检测血清的抗体效价(可用于抗体滴度和免疫效果的评价)，为一种简单、方便、快速及廉价的检测方法，适用于临床大量血清样品的检测和相关的实验室研究。附图说明图1阴阳性阈值确定依据-阴阳性血清样品在8倍本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人乙型脑炎病毒抗体固相竞争ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒内包含有包被人乙型脑炎病毒灭活抗原的ELISA板、猴抗人乙型脑炎病毒的阳性血清、人乙型脑炎病毒的阳性对照血清和人阴性对照血清。

【技术特征摘要】
1.一种人乙型脑炎病毒抗体固相竞争ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒内包含有包被人乙型脑炎病毒灭活抗原的ELISA板、猴抗人乙型脑炎病毒的阳性血清、人乙型脑炎病毒的阳性对照血清和人阴性对照血清。2.根据权利要求1所述的一种人乙型脑炎病毒抗体固相竞争ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述ELISA板上包被的人乙型脑炎病毒灭活抗原是通过细胞传代培养获得的。3.根据权利要求1所述的一种人乙型脑炎病毒抗体固相竞争ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒内还含有用于洗涤和血清稀释的PBST溶液、TMBA液、TMBB液和终止液。4.制备权利要求1~3任一项所述的一种人乙型脑炎病毒抗体固相竞争ELISA检测试剂盒的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）通过细胞传代培养获得人乙型脑炎病毒灭活抗原；（2）取步骤（1）获得的人乙型脑炎病毒灭活抗原加入ELISA板中，4℃过夜；甩干ELISA板，再用PBST溶液洗4遍；用BSA在37℃下封闭1小时，制成包被人乙型脑炎病毒灭活抗原的ELISA板；（3）制备猴抗人乙型脑炎病毒的阳性血清，添加到试剂盒中；（4）将人乙型脑炎病毒的阳性对照血清、人阴性对照血清、PBST溶液、TMBA液、TMBB液和终止液添加到试剂盒中。5.根据权利要求4所述的一种人乙型脑炎病毒抗体固相竞争ELISA检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述获得人乙型脑炎病毒灭活抗原包括以下步骤：待Vero细胞生长密度达80~85%时，取-80℃保存的105TCID50的人乙型脑炎病毒，冰上融化后用OPTI-MEM做5倍稀释，取2.5mL感染75cm2细胞瓶中细胞，37℃孵育1小时，期间每15分钟轻轻晃动2-3次，之后弃掉病毒感染液，再加入10mLOPTI-MEM，最后置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养，待细胞发生病变，病变细胞漂浮后将细胞瓶置于-80℃，反复冻融3次，之后于4℃、800...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘宗梁，李燕华，曹齐树，
申请(专利权)人：合肥知恩生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34