一种NGAL纳米高效检测试纸的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种NGAL纳米高效检测试纸制备方法，包括设在固定板上依次相连的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸收垫；在硝酸纤维素膜上设有检测线抗体和质控线抗体；在金标垫上设有金标抗体，所述的样品垫为玻璃纤维棉制成的垫，所述的金标垫为羧化纤维素膜制成的垫，所述的金标抗体为显色抗体，检测线抗体为捕捉抗体，显色抗体与捕捉抗体为2株可互相配对形成夹心的抗人H‑FABP单克隆抗体，所述的金标抗体用40nm纳米金壳标记，所述金标垫上设有功能层。本发明专利技术通过特制的含有特定功能层的金标垫，使得金标释放速度放缓，得到缓冲，从而使样本中被分析物与金标抗体的浓度比值增大，从而提高了试纸条检测的灵敏度。

A preparation method of NGAL nano high efficiency test paper

The invention discloses a preparation method of NGAL nanometer high-efficiency test paper, which comprises a sample pad, a gold pad, a nitrocellulose membrane and an absorption pad connected sequentially on a fixed plate, a detection line antibody and a quality control line antibody on a nitrocellulose membrane, a gold pad and a glass fiber pad for the sample. The gold-labeled antibody is a chromogenic antibody, the detection line antibody is a capture antibody, the chromogenic antibody and the capture antibody are two monoclonal antibodies which can pair with each other to form a sandwich of anti-human H_FABP. The gold-labeled antibody is labeled with a 40nm gold nano-shell. A function layer is provided on the label pad. The special gold pad containing a specific functional layer slows the release rate of the gold label and gets a buffer, thereby increasing the concentration ratio of the analyte and the gold labeled antibody in the sample, thereby improving the detection sensitivity of the test strip.

【技术实现步骤摘要】
一种NGAL纳米高效检测试纸的制备方法
本专利技术属于生物技术应用领域，具体地说是一种NGAL纳米高效检测试纸的制备方法。
技术介绍
NGAL(NeutrophiLGeLatinaseAssociatedLipocaLin)的分子量22KD、也有报告25KD，主要存在于中性类细胞内，其他组织中存量很少。各种原因(创伤、中毒、感染、疾病)导致急性和慢性肾损伤时，肾脏组织NGAL量明显升高释放入血液。检测血和/或尿NGAL是判断和评估急性和慢性肾损伤的生物标志物，是肾实质结构损伤的指标。类似诊断急性心肌梗死损伤的金标准心肌肌钙蛋白I、T。目前临床诊断急性和慢性肾损伤(功能不全)主要是检测血肌酐(creatine)，尿素氮、尿微量蛋白，均为肾损伤的间接功能指标。急性肾损伤后，2-3天血肌酐方出现。NGAL在急性肾损伤2-3小时后在血和尿中就明显升高，检测NGAL提前和极大提高了诊断肾实质损伤的能力的时间，对合理诊治，降低死亡率提供了客观依据。美国医院住院病人中急性肾损伤肾功能损伤患者约占总数5-7％，在医院重症病房(ICΜ)病人中比例高达25％，死亡率高达50-80％。急性和慢性肾损伤涉及心脏手术、化疗和放疗、重症高血压、糖尿病、败血症、心力衰竭、以及各种类型心肾综合征。该类病在美国麻省23家医院急性肾损伤(AKI)年花费保守估计80亿美元。因此，应用本申请专利检测NGAL将发挥巨大的社会和经济效益。。在公告号为CN102955036B文件中，在检测样本时，试纸条表面的不干胶因刀片两边的受力不同，导致试金标垫因厚度不同而导致样本在金标垫上的流速不同，导致带有金标的抗体与样本中的被分析物结合不均匀，最终会导致检测结果的显示—检测线或控制线产生断线，即线条显示不完全的现象。此外，样品中样品添加集中添加量集中，液体流速快，样本很快的冲到金标垫上，即有大量的标记物被带到了金标垫，反而使金标垫的检测灵敏度降低，且检测速度偏慢。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术中存在的不足，本专利技术的目的是提供一种中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白NGAL纳米高效检测试纸，使其具有操作简便、灵敏度＜3ng/mL、结果稳定等优点。
技术实现思路
：本专利技术提供了一种中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白NGAL纳米高效检测试纸，包括设在固定板上依次相连的样品垫、纳米材料垫、硝酸纤维素膜和吸收垫；所述硝酸纤维素膜上设有检测线抗体和质控线抗体；所述纳米材料垫为羧化纤维素膜制成的垫，纳米材料垫设有金包银纳米金壳复合物，所述的样品垫为玻璃纤维棉制成的垫，所述纳米材料垫上设有功能层。进一步地，所述功能层以质量分数计由12％纯硝酸银、70％明胶、6％的司本80、4％的环糊精，碱剂6-8％、硫酸铜0.1-0.4％、络合剂0.5-1％组成。络合剂为酒石酸钾钠。进一步地，金包银纳米金壳复合物是通过特定单链DNA将50nm和10nm纳米金包银壳标志物相联的复合物，所述特定单链DNA的核苷酸序列如SEQIDNO:1或SEQIDNO:2或SEQIDNO:3或SEQIDNO:4，所述特定单链DNA长度为30-80bp，特定单链DNA3’端标有生物素，特定单链DNA5’端连有巯基-SH。上述的中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白NGAL纳米高效检测试纸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)纳米金壳溶液的制备；(2)金壳标记制备和确认金包银壳纳米材料尺寸和纯度确定；(3)纳米材料垫的制备：将羧化纤维素膜预处理后，烘干，通过真空环境中通过红外喷涂设备分别将配制好的12％纯硝酸银、70％明胶、6％的司本80、4％的环糊精，碱剂6-8％、硫酸铜0.1-0.4％、络合剂0.5-1％喷涂至羧化纤维素膜好形成纳米材料；通过本专利技术中特定的红外喷涂方法能够较好的将组分嵌入纳米材料垫中而不影响其性能。(4)金包银纳米金壳复合物的制备，即将信号抗体与10nm和50nm金包银壳标记物相联的复合物；用0.1MK2CO3调节pH8.5-9.0；将NGAL信号单抗与纳米壳比例调整为4:100(μg/ml)；将单链DNA3'端标有生物素的30-80bpSSDNA与纳米壳信号抗体价链联接反应6-8小时，25℃，其终浓度为0.5-2.0μM；将SSDNA与纳米壳信号抗体复合物加进PEG8000终浓度为0.2-1.0％，2MNaCl/20mMphosphate调节SSDNA纳米壳复合体pH至7.4；将上述pH7.4复合体与链亲和素、辣根过氧化酶，终浓度0.4μM，在25℃条件下，孵育4小时，离心，沉淀清洗3次，保存4℃备用；(5)金壳纳米材料垫制备；(6)硝酸纤维素膜预处理和备用；(7)制备和组装金壳纳米材料垫；(8)检测线制备；(9)质控线制备；(10)试纸条装配。有益效果：本专利技术的中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白NGAL纳米高效检测试纸，结果易观察，灵敏度高，5分钟内就能判读结果，具有良好的稳定性和重复性。操作简便，无需特殊仪器设备，可应用于各种原因导致的急性肾损伤的早期诊断，慢性肾功能不全透析及治疗效果评判。相对于现有技术其检测效率大幅提升。本专利技术通过特制的含有特定功能层的纳米材料垫，使样本中被分析物与金标抗体的浓度比值增大，从而提高了试纸条检测的灵敏度。此外，通过特定功能层的纳米材料垫，通过特定比例的12％纯硝酸银、70％明胶、6％的司本80、4％的环糊精，碱剂6-8％、硫酸铜0.1-0.4％、络合剂0.5-1％的作用，避免了纳米材料垫因厚度不同而导致样本在纳米材料垫上的流速不同，导致抗体与样本中的被分析物结合不均匀，最终会导致检测结果的显示—检测线或控制线产生断线，即线条显示不完全的现象。附图说明图1是试纸条的结构示意图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步的说明。如图1所示，实施例制备的均是一种中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白NGAL纳米高效检测试纸，包括设在固定板上依次相连的样品垫1、纳米材料垫2、硝酸纤维素膜3和吸收垫4；所述硝酸纤维素膜3上设有检测线抗体5和质控线抗体6；所述纳米材料垫2为羧化纤维素膜制成的垫，纳米材料垫2设有金包银纳米金壳复合物，所述的样品垫1为玻璃纤维棉制成的垫，所述纳米材料垫上设有功能层。所述功能层以质量分数计由12％纯硝酸银、70％明胶、6％的司本80、4％的环糊精，碱剂6-8％、硫酸铜0.1-0.4％、络合剂0.5-1％组成。金包银纳米金壳复合物是通过特定单链DNA将50nm和10nm纳米金包银壳标志物相联的复合物，所述特定单链DNA的核苷酸序列如SEQIDNO:1或SEQIDNO:2或SEQIDNO:3或SEQIDNO:4，所述特定单链DNA长度为30-80bp，特定单链DNA3’端标有生物素，特定单链DNA5’端连有巯基-SH。本实验用到的材料：检测线抗体为抗人NGAL单克隆抗体BOT06为捕捉抗体，质控线抗体为羊抗鼠IgG，金壳标记抗体包含有显色抗体为鼠抗人NGAL抗体BOT05，购买于GenscriptTheBiologyCRO南京公司。金包银纳米金壳复合物所用到的特定单链DNA是由本公司设计合成制得。其他材料均自市场上购买。本专利是针对本公司专利公告号为CN102955036B的改进，某些现有技术参照其内容作省略。实施例1(1)纳米金壳溶液的制备：以柠檬酸钠和鞣酸为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种NGAL纳米高效检测试纸的制备方法，其特征在于，包括设在固定板上依次相连的样品垫(1)、纳米材料垫(2)、硝酸纤维素膜(3)和吸收垫(4)；所述硝酸纤维素膜(3)上设有检测线抗体(5)和质控线抗体(6)；所述纳米材料垫(2)为羧化纤维素膜制成的垫，纳米材料垫(2)设有金包银纳米金壳复合物，所述的样品垫(1)为玻璃纤维棉制成的垫，所述纳米材料垫上设有功能层；所述功能层以质量分数计由12％纯硝酸银、70％明胶、6％的司本80、4％的环糊精，碱剂6‑8％、硫酸铜0.1‑0.4％、络合剂0.5‑1％组成；其制备步骤包括如下：(1)纳米金壳溶液的制备；(2)金壳标记制备和确认金包银壳纳米材料尺寸和纯度确定；(3)纳米材料垫的制备：将羧化纤维素膜预处理后，烘干，通过真空环境中通过红外喷涂设备分别将配制好的12％纯硝酸银、70％明胶、6％的司本80、4％的环糊精，碱剂6‑8％、硫酸铜0.1‑0.4％、络合剂0.5‑1％喷涂至羧化纤维素膜好形成纳米材料；(4)金包银纳米金壳复合物的制备，即将信号抗体与10nm和50nm金包银壳标记物相联的复合物；用0.1MK2CO3调节pH8.5‑9.0；将NGAL信号单抗与纳米壳比例调整为4:100(μg/ml)；将单链DNA3'端标有生物素的30‑80bpSSDNA与纳米壳信号抗体价链联接反应6‑8小时，25℃，其终浓度为0.5‑2.0μM；将SSDNA与纳米壳信号抗体复合物加进PEG8000终浓度为0.2‑1.0％，2MNaCl/20mMphosphate调节SSDNA纳米壳复合体pH至7.4；将上述pH7.4复合体与链亲和素、辣根过氧化酶，终浓度0.4μM，在25℃条件下，孵育4小时，离心，沉淀清洗3次，保存4℃备用；(5)金壳纳米材料垫制备；(6)硝酸纤维素膜预处理和备用；(7)制备和组装金壳纳米材料垫；(8)检测线制备；(9)质控线制备；(10)试纸条装配。...

【技术特征摘要】
1.一种NGAL纳米高效检测试纸的制备方法，其特征在于，包括设在固定板上依次相连的样品垫(1)、纳米材料垫(2)、硝酸纤维素膜(3)和吸收垫(4)；所述硝酸纤维素膜(3)上设有检测线抗体(5)和质控线抗体(6)；所述纳米材料垫(2)为羧化纤维素膜制成的垫，纳米材料垫(2)设有金包银纳米金壳复合物，所述的样品垫(1)为玻璃纤维棉制成的垫，所述纳米材料垫上设有功能层；所述功能层以质量分数计由12％纯硝酸银、70％明胶、6％的司本80、4％的环糊精，碱剂6-8％、硫酸铜0.1-0.4％、络合剂0.5-1％组成；其制备步骤包括如下：(1)纳米金壳溶液的制备；(2)金壳标记制备和确认金包银壳纳米材料尺寸和纯度确定；(3)纳米材料垫的制备：将羧化纤维素膜预处理后，烘干，通过真空环境中通过红外喷涂设备分别将配制好的12％纯硝酸银、70％明胶、6％的司本80、4％的环糊精，碱剂6-8％、硫酸铜0.1-0.4％、络合剂0.5-1％喷涂至羧化纤维素膜好形成纳米材料；(4)金包银纳米金壳复合物的制备，即将信号抗体与10nm和50nm金包银壳标记物相联的复合物；用0.1MK2CO3调节pH8.5-9.0；将NGAL信号单抗与纳米壳比例调整为4:100(μg/ml)；将单链DNA3'端标有生物素的30-80bpSSDNA与纳米壳信号...

【专利技术属性】
技术研发人员：张雷，
申请(专利权)人：南京博天科智生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32