表征细胞特异性微囊泡的方法技术

本发明专利技术涉及用于表征和/或测量和/或分选心脏衍生微囊泡的量的方法，其包括在获得自对象的分离生物样品中检测微囊泡上CD172a标志物的步骤。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】表征细胞特异性微囊泡的方法
本专利技术涉及用于表征、定量和分选循环细胞特异性微囊泡(MV)，特别是心脏衍生MV的方法。本专利技术还涉及这样的方法，其通过表征、定量和分选循环心脏衍生微囊泡(MV)，用于对疾病，特别是心血管疾病进行诊断和/或评估成病风险和/或预后和/或监测进展和/或监测治疗性处理的功效和/或筛选治疗性处理。
技术介绍
在所有经济发达的国家，心血管疾病仍然是在成人中导致发病率和死亡率的主要原因。由于这些疾病潜在的病理过程的异质性，鉴定与心血管疾病的高风险相关的明确生物标志物很大程度上仍然难以捉摸。因此，构建能够改善心血管疾病(CVD)早期检测的新型技术方法可以带来对于患者更精确的干预和治疗。胞外囊泡(EV)是细胞间通信的关键因素，并且在基础或应激条件下释放。EV包括凋亡小体(AB)、微囊泡(MV)和外泌体，其源自不同的亚细胞隔室[Raposo,等JCellBiol.2013年2月18日；200(4):373-83]。具体而言，MV在与质膜融合后由其起源细胞释放。值的注意的是，循环MV的表征可以改善针对症状发生前疾病的病理生理学信息，从而对患者风险分级以及候选治疗途径更好的评估。缺乏用于选择性表征和定量循环心脏衍生MV的方法是难以将该技术应用于疾病分期(diseasestaging)和预测急性事件的限制因素。因此，人们仍然需要用于选择性地表征和定量心脏衍生MV的方法。
技术实现思路
本申请专利技术人发现，处于应激条件下时，循环细胞特异性微囊泡(MV)，特别是心脏衍生MV水平是心血管系统病理状态的可靠指标。事实上，本申请专利技术人发现，经过称之为经导管主动脉瓣植入术(TranscatheterAorticValveImplantation，TAVI)的微创性手术之后，循环心脏衍生MV和循环内皮细胞衍生MV浓度急剧下降。这一“原理论证”具有病理生理学价值。本申请专利技术人开发了一种简单、准确且强大的工具，用于针对疾病预测、分期和药物响应性来表征、定量和分选循环组织衍生MV，主要集中于心脏衍生MV。专利技术人将其方法基于依序步进式门控策略，该门控策略使用多色流式细胞术(FACS)。专利技术人对FACS分析进行优化以同时表征、定量和分选循环组织衍生MV，包括AB和/或膜碎片。本专利技术的方法可以被用于对患有心力衰竭、心肌症和瓣膜病的患者进行分期，并且在患有急性冠状动脉综合征患者中预测疾病严重性，包括对主要不良心脏结果具有预后/预测作用的药物响应性概况。值的注意的是，本方法不仅可以在严格意义上的CVD中进行，也可以在其它病变诸如自身免疫疾病(类风湿性关节炎、关节炎牛皮癣、风湿性多肌痛、狼疮、硬皮病自身免疫性紊乱等等)中进行。心血管并发症是自身免疫疾病的主要消极结果，原因可以是炎症状态或药物响应性。此外，许多癌症疗法(即，乳腺癌、霍奇金淋巴瘤等)诱导心脏毒性，其可能导致心力衰竭和其它心血管消极结果。本专利技术的方法高度适用于与CVD直接(即，心力衰竭)和/或间接(即，个体药物响应)紧密关联的不同方面，主要意义在于临床管理和个性医疗。本方法使用抗CD172a抗体能够准确区分循环心脏衍生MV，而此前未见抗CD172a抗体与心肌衍生MV关联。临床主要主要采用心肌损伤(如肌钙蛋白T(cTnT))或心力衰竭(如NT-proBNP)的常规生物标志物，然而它们在许多医学病理条件中性能不佳。市售抗体捕获(antibodycapture)包覆磁珠，用于多色分析的定制干燥抗体混合物，和/或具有一定大小滤芯的柱和/或联合特异性抗体过滤器(SAF)可以专门用来或经研发用来实施本方法。本专利技术还可以用于针对MV分选的研究领域。纯化的MV子集可以用于对其含量和功能的分析(即，蛋白质组分析、下一代测序等)。获得的发现将增加对于CDV发病机理和药物响应性的认识。本申请专利技术人设计的组中所用所有抗体识别表达在MV表面的特异性标志物，因此大幅度地减少细胞内染色常见的背景信号。经设计的抗体7x7矩阵(表1)能够准确区分目标心脏(CD172a+)循环组织衍生MV子集，策略性地被作为最后一个参数。然而，本文矩阵具有高度的适应性，可用于不同的研究设计以及最后两位(R13和R14)主目标循环组织衍生MV子集的不同抗体选择组合，并且可以使用不同数量的抗体(“nxn”矩阵)来设计，这些与以后的临床应用有关。事实上，可以替换矩阵中一个或多个抗体(或添加或去除一个或多个抗体)，用于表征和测量不同器官(不仅仅是心脏)释放的微囊泡的量。已知应激条件下的器官，例如，肾脏、肝脏等，显示微囊泡释放改变[WangY,等StemCellResTher.201522；6:100][LemoinneS,等NatureReviewsGastroenterology&Hepatology,201411,350–361][EttelaieC,等MicrovascRes2008；76:152–60][RoyoF,JExtracellVesicles.2012年7月11日；1]。专利技术详述因此，本
技术实现思路
之一是一种用于表征和/或测量循环组织衍生微囊泡(MV)子集数量的方法，其包括以下步骤：在获自对象的分离生物样品中，至少检测所述微囊泡上的CD172a标志物，其中，如果微囊泡呈CD172a阳性，那么将微囊泡表征为心脏衍生微囊泡。优选地，本专利技术的方法是离体或体外方法，更优选地是离体方法。本专利技术的方法优选还包括进一步检测选自下组的至少一个标志物的步骤：CD235a、CD61、CD144、CD14、CD45、CD73、CD3或其组合。在本专利技术更优选的实施方式中，待检测的标志物是CD172a、CD235a、CD61、CD144、CD14、CD45和CD73。可以任何顺序检测标志物，优选以下述次序：CD235a、CD61、CD144、CD14、CD45、CD172a和CD73。更优选地，同时检测标志物CD45和CD14。在本专利技术的优选实施方式中：-如果微囊泡呈CD235a阳性，那么微囊泡被表征为红细胞衍生MV；-如果微囊泡呈CD61阳性，那么微囊泡被表征为血小板衍生MV；-如果微囊泡呈CD144阳性，那么微囊泡被表征为内皮细胞衍生MV；-如果微囊泡呈CD14阳性，那么微囊泡被表征为单核细胞衍生MV；-如果微囊泡呈CD45阳性，那么微囊泡被表征为白细胞衍生MV；-如果微囊泡呈CD37阳性，那么微囊泡被表征为基质/脂肪细胞衍生MV。在优选的实施方式中，如果微囊泡呈CD3和/或CD45阳性，那么微囊泡是白细胞衍生MV。CD3标志物可与CD45联用以更好的区分白细胞衍生MV。本专利技术的另一内容是一种用于在对象中对心血管疾病(CVD)进行诊断和/或评估成病风险和/或预后和/或监测进展和/或监测治疗性处理的功效和/或筛选治疗性处理的方法，所述方法包括如下步骤：a)根据上述定义方法表征和/或测量循环组织衍生微囊泡子集的量；b)与合适的对照和/或参照进行比较。优选地，上述方法是离体或体外方法，更优选地是离体方法。在优选的实施方式中，获自对象的分离生物样品中心脏衍生MV的量比对照量高，这表示该对象患有心血管疾病(CVD)或者发展成CVD的风险增加，所述CVD优选原发性或继发性心力衰竭。在本专利技术方法的其它实施方式中，获自对象的分离生物样品中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于表征和/或测量循环组织衍生微囊泡(MV)子集数量的离体或体外方法，所述方法包括以下步骤：在获自对象的分离生物样品中至少检测所述微囊泡上的CD172a标志物，其中，如果所述微囊泡呈CD172a阳性，将所述微囊泡表征为心脏衍生微囊泡。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.11.06 EP 15193500.41.一种用于表征和/或测量循环组织衍生微囊泡(MV)子集数量的离体或体外方法，所述方法包括以下步骤：在获自对象的分离生物样品中至少检测所述微囊泡上的CD172a标志物，其中，如果所述微囊泡呈CD172a阳性，将所述微囊泡表征为心脏衍生微囊泡。2.如权利要求1所述的离体或体外方法，其还包括进一步检测选自下组的至少一个标志物的步骤：CD235a、CD61、CD144、CD14、CD45、CD73、CD3或其组合。3.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，待检测的所述标志物是CD172a、CD235a、CD61、CD144、CD14、CD45和CD73。4.如权利要求2-3中任一项所述的方法，其中，-如果所述微囊泡呈CD235a阳性，将所述微囊泡表征为红细胞衍生MV；-如果所述微囊泡呈CD61阳性，将所述微囊泡表征为血小板衍生MV；-如果所述微囊泡呈CD144阳性，将微囊泡表征为内皮细胞衍生MV；-如果所述微囊泡呈CD14阳性，将所述微囊泡表征为单核细胞衍生MV；-如果所述微囊泡呈CD45阳性，将所述微囊泡表征为白细胞衍生MV；-如果所述微囊泡呈CD37阳性，将所述微囊泡表征为基质/脂肪细胞衍生MV。5.一种离体或体外方法，其用于对对象中心血管疾病(CVD)进行诊断和/或评估成病风险和/或预后和/或监测进展和/或监测治疗性处理的功效和/或筛选治疗性处理，所述方法包括如下步骤：a)根据如权利要求1-4中任一项所述的方法表征和/或测量循环组织衍生微囊泡子集的量；b)与合适的对照和/或参照进行比较。6.如权利要求5所述的方法，其中，获自所述对象的分离生物样品中心脏衍生MV的量比所述对照量高，这表示所述对象患有心血管疾病(CVD)或者发展成CVD的风险增加。7.如权利要求5所述的方法，其中，获自所述对象的分离生物样品中心脏衍生MV的量比所述对照量低，则表示所述对象朝着CVD改善的方向发展。8.如权利要求7所述的方法，其中，所述对象接受瓣膜置换，优选经导管主...

【专利技术属性】
技术研发人员：G·康德雷利，A·安塞尔莫，C·维维安妮安塞尔密，L·帕帕，
申请(专利权)人：博爱米拉索勒股份公司，
类型：发明
国别省市：意大利,IT