筛选的方法技术

本发明专利技术提供了使用哺乳动物编码的肽(SEP)，例如短开放阅读框(sORF)编码的肽，鉴定靶蛋白上的肽相互作用位点的方法，其中所述靶蛋白调节哺乳动物细胞的表型。本发明专利技术进一步提供了用于鉴定在药物发现中使用的新的治疗靶和蛋白质相互作用位点的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】筛选的方法专利
本专利技术涉及用于鉴定在药物发现中使用的新的治疗靶和新的可成药的(druggable)蛋白质相互作用位点的方法。专利技术背景新的治疗靶的鉴定是药物发现的关键起点。药物发现工作传统上集中于鉴定经典的可成药靶，例如激酶、G蛋白偶联受体(GPCR)和离子通道。然而，此类化学上容易获得的靶并不总是代表生物学上最相关的用于治疗干预的靶。将蛋白质:蛋白质相互作用(PPI)成药特别令人感兴趣，因为这些蛋白质相互作用代表了参与癌细胞利用的缺陷信号传导通路中的主要靶类型，以及人类疾病中一大组潜在可作用的接口。不幸的是，对将PPI和其他“不可成药”的靶成药的系统尝试受到技术的限制，这在很大程度上是由于当前基于DNA和RNA的高通量基因组学技术能在蛋白质组水平上鉴定新的可成药空间的限制。可以使用无偏的“表型”测定来鉴定与疾病生物学相关的候选药物靶的目前基于基因组学的技术，通常是使用基因敲除(例如CRISPR)来执行，或者在转录物组水平上使用RNAi来执行。这些方法产生了关于哪些靶可以代表在疾病进展和疾病治疗干预中的重要节点的重要信息，但是受到严重限制：因为它们是在基因水平而不是蛋白质水平上进行筛选，所以它们无法确定如何将那些靶成药，也无法作为过程中固有的一部分来确定那些是否代表可成药的候选物。这是因为这样的基因筛选除去了靶蛋白而不是抑制它们。为了获得此类重要的关于可成药性的另外信息，将需要使用新的高通量蛋白质组水平筛选技术；一种可以处理比基因功能(～30,000个基因及其剪接变体)更高复杂性的筛选蛋白质功能(>300,000个独特的蛋白质转录本和数百万个独特的PPI)的筛选技术。最近，随着DNA编码的、蛋白片段表达文库的引入，直接在人蛋白质组中系统鉴定新的药物靶位点获得了一定程度的可操作性和关注，这些文库可以在表型测定中以高通量筛选(诸如WO2013/116903中所描述的)；常被称为“蛋白质干扰”(Protein-i)。这种蛋白质片段文库(通常来源于不同的细菌基因组)，由形成更大蛋白质的进化构建模块的小的自折叠子结构域组成。当组装为用于哺乳动物细胞中细胞内表达的文库时，它们代表用于对接靶蛋白和探索跨越人蛋白质组的候选的新的可成药位点的三维形状的高度多样化集合。至关重要的是，这些蛋白质片段小到足以描述靶蛋白质中离散的空间位点(discretespatialsites)，因此可以用随后设计成与该形状匹配的小分子药物重现。此外，由于蛋白质片段文库比目前的小分子文库描述了多得多的形状，这为指导对于新的有效靶的未来小分子药物的合理设计提供了更加可靠的方法。尽管由于细菌基因组主要由编码序列组成，细菌衍生的蛋白片段文库已显示在Protein-i筛选中是有效的，并且通过片段化和克隆到表达文库中而高效率/直接地产生。然而，与使用哺乳动物或人蛋白质组本身的片段相比，它们可在拥有大比例的能与哺乳动物(例如人)蛋白功能性地相互作用的蛋白片段方面动力不足。然而，直接从哺乳动物(例如人)的基因组创建蛋白质片段文库的复杂性在于，高等生物具有大量得多的编码序列，因此通常需要大量人工定制克隆来将其片段组装为表达文库，以用于表型筛选。这是因为高等生物的DNA大部分地含有非编码序列(估计人DNA的>95％是非编码的)，并且编码序列的绝对数量要大得多。因此，它们需要一种独特和特别的方法将其片段组装为表达文库用于表型筛选。迄今为止描述的那些细菌衍生的蛋白质片段文库(例如在WO2013/116903中)是通过机械剪切(mechanicallyshearing)基因组并将片段随机插入载体中获得的。这产生对于细菌中的原始基因为符合读框(1:6的机会)或不符合读框(5:6的机会)的许多随机大小的片段。对于真核生物来说，同样的策略是行不通的，因为它们的DNA大部分是非编码的。此外，细菌衍生的蛋白质片段文库诸如这些没有“清单”，即，因为序列是随机克隆的，所以除了通过非常深的测序之外，不可能准确说出给定文库中包含的内容。这些实际的限制导致了在人类细胞的靶鉴定和验证筛选中，挖掘直接相关蛋白质折叠结构多样性的潜在丰富的替代矿脉时存在显著的惰性。其它筛选方法描述于例如WO01/86297中。这里产生随机短(40-mer和20-mer)肽噬菌体展示文库，并将该文库用于寻找结合到预先选择的靶或已知的、预先鉴定的共有基序的肽。这依赖于已知/已识别的现有的疾病靶，并且不利于鉴定新的靶。因此，本专利技术的目的是提供筛选哺乳动物蛋白和/或蛋白片段文库的方法。专利技术概述在一方面，本专利技术提供了鉴定调节哺乳动物细胞的表型的靶蛋白的方法，所述方法包括将能够显示所述表型的体外培养的哺乳动物细胞群体暴露于SEP(“短表达肽(shortexpressedpeptide)”)的文库；在所述暴露后在所述细胞群体中鉴定所述表型的改变，选择经历表型改变的所述细胞并鉴定改变细胞的表型的SEP，提供所述SEP并鉴定结合所述SEP的细胞蛋白，所述细胞蛋白是调节哺乳动物细胞的表型的靶蛋白。“SEP”是衍生自DNA编码序列文库的“短表达肽”。SEP是短肽(<150个氨基酸)。在优选的实施方案中，SEP是6至130个氨基酸、优选6至100个氨基酸的肽。这样的肽可以是多达20、30、40、45、46、50、60个或更多个氨基酸。例如，这样的肽可以是6至45个氨基酸或6至60个、6至70个、6至80个、6至90个或60至100个氨基酸。在一种实施方案中，SEP是40个或更多个氨基酸，优选40至60个氨基酸的肽。SEP由核苷酸序列片段编码。如本文所用，术语“SEP”可以指肽或氨基酸序列，或者指编码所述肽/氨基酸序列的核酸序列。在一种实施方案中，SEP是哺乳动物的，适合地是人的。它们代表了尚未开发的生物功能性肽库，用于定义人基因组中潜在的新的功能性可成药靶。在本专利技术任何方面的一种实施方案中，“SEP文库”可以包括由来自单一物种、生物或个体的或来自混合来源的核酸分子编码的肽。有利的是，“SEP文库”是来自单一生物的，优选哺乳动物，例如人。“SEP文库”可以指肽文库或编码所述肽的核酸分子文库。在本专利技术的任何方面的一种实施方案中，SEP文库包含衍生自哺乳动物例如人的核酸序列的肽。有利的是，根据本专利技术的SEP文库经由计算机模拟设计成仅使用来自蛋白质组共有数据库的表达的蛋白质。另外，在一种实施方案中，文库中的SEP是固定大小的(这在文库产生/克隆和在下一代测序(NGS)分析/筛选中是有利的)。因此，合适的是，文库包含6至100个氨基酸的SEP(或编码它们的核酸分子)，优选40或45至100个氨基酸的SEP。此外，根据本专利技术的人类文库被设计成符合读框(没有由于移码而过早停止)，并且表达的肽100％的时间与人蛋白匹配。进一步地，根据本专利技术的人类文库跨人类蛋白质组中的所有蛋白质分布，并且以完整的清单存在，因为片段是通过大规模平行合成而不是随机克隆过程产生的。在另一种实施方案中，文库还可以进一步包括来自微生物的肽和/或来自真核物种的小基因组的肽。在一种实施方案中，文库可以包括由与来自非细菌序列的序列(例如哺乳动物衍生的序列)组合的细菌衍生的文库编码的肽(参见例如WO2013/116903和其本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鉴定调节哺乳动物细胞的表型的靶蛋白的方法，所述方法包括将能够显示所述表型的体外培养的哺乳动物细胞群体暴露于SEP文库，在所述暴露后鉴定所述细胞群体中所述表型的改变，选择经历表型改变的所述细胞并鉴定改变所述细胞的所述表型的SEP，提供所述SEP并鉴定结合所述SEP的细胞蛋白，所述细胞蛋白是调节所述哺乳动物细胞的表型的靶蛋白。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.12.22 GB 1522618.61.一种鉴定调节哺乳动物细胞的表型的靶蛋白的方法，所述方法包括将能够显示所述表型的体外培养的哺乳动物细胞群体暴露于SEP文库，在所述暴露后鉴定所述细胞群体中所述表型的改变，选择经历表型改变的所述细胞并鉴定改变所述细胞的所述表型的SEP，提供所述SEP并鉴定结合所述SEP的细胞蛋白，所述细胞蛋白是调节所述哺乳动物细胞的表型的靶蛋白。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述SEP文库包含人SEP。3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中所述SEP文库包括sORF的肽产物。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述SEP是6-130个氨基酸的肽或编码所述肽的核酸序列。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述SEP是6至100个氨基酸的肽或编码所述肽的核酸序列。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞蛋白和所述SEP用在鉴定结合所述细胞蛋白并破坏SEP结合的配体的测定中。7.一种鉴定与靶蛋白结合并置换或阻断所述SEP结合的化合物的方法，其中所述化合物调节哺乳动物细胞的表型，所述方法包括以下步骤：i.将能够显示所述表型的体外培养的哺乳动物细胞群体暴露于SEP文库；ii.在所述暴露后鉴定所述群体中显示所述表型的改变的细胞；iii.鉴定改变所述细胞的所述表型的SEP；iv.鉴定结合所述SEP的细胞蛋白，所述细胞蛋白是调节所述哺乳动物细胞的所述表型的靶蛋白；v.鉴定结合所述靶蛋白并置换或阻断...

【专利技术属性】
技术研发人员：布林·肖恩·哈德威克，格雷厄姆·詹姆斯·麦肯齐，
申请(专利权)人：福慕斯特有限公司，
类型：发明
国别省市：英国,GB