一种丝素蛋白纳米球的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种丝素蛋白纳米球的制备方法。将桑蚕丝或柞蚕丝脱胶后获得丝素蛋白，再将丝素蛋白溶解、透析形成一定浓度的丝素蛋白溶液，将无水乙醇与丝素蛋白水溶液按一定比例混合均匀后冷冻，再经离心、清洗、干燥即可获得丝素蛋白纳米球。将丝素蛋白水溶液与功能蛋白分子如bFGF‑2，IGF‑1，EGF，BMP‑2，OP‑1等混合可制备功能性丝素蛋白微球。该制备过程安全、简便，污染小，可稳定制备粒径均一的丝素蛋白纳米球，适合注射，可用作药物载体、缓释系统等领域。

Method for preparing silk fibroin nano ball

The invention discloses a method for preparing silk fibroin nanospheres. The silk or silk degummed silk fibroin obtained, the silk fibroin dissolution and dialysis formed a certain concentration of silk fibroin solution, ethanol and silk fibroin solution are evenly mixed according to certain ratio by freezing, centrifugation, washing and drying to obtain the silk fibroin nanoparticles. The silk fibroin aqueous solution and the function of protein molecules such as bFGF 2, IGF 1, EGF, BMP 2, OP 1 mixed preparation of functional silk fibroin microspheres. The preparation process is safe, simple and less polluting, and can be used to prepare the fibroin nano ball with uniform particle size, which is suitable for injection and can be used as a drug carrier and a sustained release system.

【技术实现步骤摘要】
一种丝素蛋白纳米球的制备方法(一)
本专利技术涉及一种适用于控制药物缓释的丝素蛋白基纳米球的制备方法，属于生物医学
(二)
技术介绍
目前，从生物医用材料的发展趋势看来，人工合成聚合物等不可降解或者降解产物的生物相容性欠佳的材料将逐步减少，而具备良好的生物相容性及体内可吸收性的天然生物材料将受到青睐。天然生物材料在结构、力学、和生物降解性能可控的情况下，在临床应用中具备巨大潜力。在众多天然生物材料中，来源于天然蚕丝的丝素蛋白，由于其易加工、生物相容性好，力学强度高，降解速率慢，降解产物为氨基酸等优点，近年来，在组织工程领域被广泛研究。例如，通过编织可以制备网状支架材料用于软组织加强，通过冷冻干燥技术可以制备多孔海绵状支架材料用于骨组织修复，通过高压电喷技术可以制备出微球结构支架材料用于药物缓释等。其中，在药物缓释载体中，丝素蛋白由于降解缓慢，且降解产物为氨基酸，人体可吸收，无毒副作用，提供了一种新的选择。同时，将丝素蛋白与药物复合制备成球状适合注射，同时丝素蛋白分子的特殊分子结构有利于稳定敏感性分子的结构，保护蛋白类功能分子生物活性，有利于临床应用。在以往的丝素蛋白微球、纳米球的制备过程中，多采用高压电喷法、反相乳液法、喷雾干燥法等方法制备。其中，高压电喷法需要在高压静电场中进行，对设备要求较高，产量较低；反相乳液法容易在材料中引入有机杂质；喷雾干燥法制备的丝素蛋白球粒径均一性有待改进，且工艺复杂，设备要求高。在此，本专利技术提供了一种简便的丝素蛋白纳米球制备方法，可稳定制备粒径均一的丝素蛋白纳米球。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种简便的丝素蛋白纳米球制备方法，快速、稳定地获得粒径均一、分散性良好的丝素蛋白纳米球，同时最大程度减少有机试剂在制备过程中的应用，以减少生产过程中的污染同时提高产物的生物安全性。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种丝素蛋白纳米球的制备方法，所述方法为：将质量浓度0.1％～5％的丝素蛋白水溶液与无水乙醇(优选4℃预冷1h)充分混合，-25℃～-18℃下冷冻12～24小时，再在4～40℃下解冻，离心(优选4000-15000rpm)，取沉淀用去离子水清洗(优选去离子水体积用量为沉淀体积的5-20倍)，重复离心和水洗(优选重复3-10次)，取最后一次水洗后的沉淀干燥(优选下列方式之一进行干燥：20-25℃室温干燥、40℃真空热干燥或--30℃冷冻干燥)，即为丝素蛋白纳米球；所述无水乙醇与丝素蛋白水溶液体积比为1～10:10。进一步，所述丝素蛋白水溶液按如下方法制备：将蚕茧剪碎后浸入质量浓度0.2％无水碳酸钠水溶液(优选无水碳酸钠水溶液体积用量以蚕茧质量计为0.1g/L)，煮沸60～120分钟，过滤，取滤饼用去离子水清洗，50℃干燥，获得丝素蛋白纤维；将丝素蛋白纤维溶于9.3mol/L溴化锂水溶液或三元溶液(优选在65-70℃溶解，所述溴化锂水溶液或三元溶液体积用量以能够溶解为准，优选以蚕茧质量计为5-10ml/g)中，以去离子水为透析液进行透析，取透过液用去离子水配制成质量浓度0.1％～5％的丝素蛋白水溶液；所述三元溶液由氯化钙、乙醇、水以体积比为1:2:8混合而成。进一步，所述丝素蛋白水溶液中添加有功能药物，所述功能药物为生长因子bFGF-2、促生长因子IGF-1、表皮细胞生长因子EGF、重组人骨形态发生蛋白BMP2、成骨蛋白OP-1、阿霉素或盐酸吉西他滨中的一种。进一步，所述功能药物添加量以丝素蛋白水溶液体积计为10-100μg/L，优选10-75μg/L。进一步，所述功能药物加入到丝素蛋白水溶液中，2-8℃、30-150rpm充分混合5-6分钟，即获得含功能药物的丝素蛋白水溶液。进一步，所述方法按如下步骤制备：(1)将桑蚕或柞蚕的蚕茧剪碎加入质量浓度0.2％无水碳酸钠水溶液中煮沸60～120分钟，过滤，滤饼用去离子水洗涤，50℃干燥，获得丝素蛋白纤维；(2)将丝素蛋白纤维溶于9.3mol/L溴化锂水溶液或三元溶液中(优选在65-70℃溶解)，加入透析袋中，以去离子水为透析液透析2-4天，取透过液用去离子水配制成质量浓度0.1％～5％的丝素蛋白水溶液；所述透析袋截留分子量为3500；(3)将功能药物溶于步骤(2)丝素蛋白水溶液，于2-8℃、30-150rpm充分混合5-6分钟，获得含药丝素蛋白水溶液；所述功能药物为生长因子bFGF-2或重组人骨形态发生蛋白BMP2；(4)将丝素蛋白水溶液或含药丝素蛋白水溶液与无水乙醇以体积比1～3:1混合，-20℃下冷冻12～24小时；再于20～35℃下解冻，4000-15000rpm离心后，取沉淀用5-20倍体积的去离子水清洗，重复离心和水洗过程3-10次；取最后一次水洗后的沉淀，通过20-25℃室温干燥、40℃真空热干燥或-30℃冷冻干燥，获得所述丝素蛋白纳米球。与现有技术相比，本专利技术的有益效果主要体现在：前期的制备方法多采用高压电喷法或反相乳液法制备，操作较为复杂，且使用大量有机试剂。本专利技术制备过程操作简便，不涉及高压、极端温度等条件，使用设备简单易得，适合稳定批量生产；其次，所用试剂安全性高污染小，对制备过程环境影响小，材料中残留的试剂可通过水洗除去，有利于提高产物的生物安全性。(四)附图说明图1丝素蛋白纳米球的扫描电镜图。图2丝素蛋白纳米球在大鼠皮下注射。(a)皮下注射造模；(b)皮下注射1周后；(c)皮下注射3个月后。(五)具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此：实施例1：将50g桑蚕蚕茧剪碎，放入5L沸腾的质量浓度0.2％无水碳酸钠水溶液中，持续煮沸90分钟进行脱胶处理，过滤，收集滤饼，用去离子水反复清洗5遍，除去表面残留的碳酸钠，后50℃干燥，即为丝素蛋白纤维。将干燥后的丝素蛋白纤维溶解于250mL9.3mol/L溴化锂水溶液(65℃)，完全溶解后，将丝素蛋白溶液装入透析袋(截留分子量：3500)中，于去离子水中透析3天，每天换水2次，除去溴化锂。用去离子水将透析后获得的丝素蛋白水溶液浓度调整至质量浓度1％。无水乙醇于4℃冰箱中预冷1小时。取10mL无水乙醇加入100mL、质量浓度1％丝素蛋白水溶液中，迅速混合均匀，容器封口后放入-20℃冰箱中冷冻18小时后，取出混合液，于20℃解冻，得到的悬浊液使用离心机于12000rpm离心30分钟后，去掉上清，用100mL去离子水清洗沉淀物，重复该清洗、离心步骤5遍，最后将沉淀物于20℃晾干，即可得到丝素蛋白纳米球。使用扫描电子显微镜观察获得的丝素蛋白纳米球(图1)，其分散良好，直径为100nm～200nm。实施例2：将50g柞蚕蚕茧剪碎，放入5L沸腾的质量浓度0.2％无水碳酸钠水溶液中，持续煮沸120分钟进行脱胶处理，过滤，收集滤饼，用去离子水反复清洗获得的丝素蛋白纤维5遍，除去表面残留的碳酸钠，后50℃干燥，即为丝素蛋白纤维。将干燥后的丝素蛋白纤维溶解于500ml、70℃三元溶液(氯化钙/乙醇/水体积比为1:2:8)中，完全溶解后，将丝素蛋白溶液装入透析袋(截留分子量：3500)中，于去离子水去离子水中透析4天，每天换水2次，除去残留溶剂。用去离子水将透析后获得的丝素蛋白水溶液浓度调整至质量浓度5％。将5μgbFGF-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种丝素蛋白纳米球的制备方法，其特征在于所述方法为：将质量浓度0.1％～5％的丝素蛋白水溶液与无水乙醇充分混合，‑25℃～‑18℃下冷冻12～24小时，再在4～40℃下解冻，离心，取沉淀用去离子水清洗，重复离心和水洗，取最后一次水洗后的沉淀干燥，即为丝素蛋白纳米球；所述无水乙醇与丝素蛋白水溶液体积比为1～10:10。

【技术特征摘要】
1.一种丝素蛋白纳米球的制备方法，其特征在于所述方法为：将质量浓度0.1％～5％的丝素蛋白水溶液与无水乙醇充分混合，-25℃～-18℃下冷冻12～24小时，再在4～40℃下解冻，离心，取沉淀用去离子水清洗，重复离心和水洗，取最后一次水洗后的沉淀干燥，即为丝素蛋白纳米球；所述无水乙醇与丝素蛋白水溶液体积比为1～10:10。2.如权利要求1所述丝素蛋白纳米球的制备方法，其特征在于所述丝素蛋白水溶液按如下方法制备：将蚕茧剪碎后浸入质量浓度0.2％无水碳酸钠水溶液，煮沸60～120分钟，过滤，取滤饼用去离子水清洗，50℃干燥，获得丝素蛋白纤维；将丝素蛋白纤维溶于9.3mol/L溴化锂水溶液或三元溶液中，以去离子水为透析液进行透析，取透过液用去离子水配制成质量浓度0.1％～5％的丝素蛋白水溶液；所述三元溶液由氯化钙、乙醇、水以体积比为1:2:8混合而成。3.如权利要求1所述丝素蛋白纳米球的制备方法，其特征在于所述无水乙醇为4℃预冷无水乙醇。4.如权利要求1所述丝素蛋白纳米球的制备方法，其特征在于所述丝素蛋白水溶液中添加有功能药物，所述功能药物为生长因子bFGF-2、促生长因子IGF-1、表皮细胞生长因子EGF、重组人骨形态发生蛋白BMP2、成骨蛋白OP-1、阿霉素或盐酸吉西他滨中的一种。5.如权利要求4所述丝素蛋白纳米球的制备方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪燕艳，邹晓晖，赵洪石，
申请(专利权)人：浙江大学，浙江星月生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33