本发明专利技术公开了针对绿色荧光蛋白(EGFP)的纳米抗体及其决定抗体特异性的互补决定区(CDR)编码序列。所述抗体是含有SEQ ID NO:1所示互补决定区1氨基酸序列、SEQ ID NO:2所示互补决定区2氨基酸序列及SEQ ID NO:3所示互补决定区3氨基酸序列。本发明专利技术的一种针对EGFP纳米抗体能够良好地特异性结合绿色荧光蛋白。
A nano antibody targeting green fluorescent protein and its coding sequence
The present invention discloses a nano-antibody against green fluorescent protein (EGFP) and a complementary determinant region (CDR) coding sequence determining antibody specificity. The antibody contains the sequence of 1 amino acid in the complementary determinant region shown in SEQ ID NO:1, 2 amino acid in the complementary determinant region shown in SEQ ID NO:2 and 3 amino acid in the complementary determinant region shown in SEQ ID NO:3. The EGFP nano antibody of the invention can be well combined with green fluorescent protein.
【技术实现步骤摘要】
一种针对绿色荧光蛋白的纳米抗体及其编码序列
本专利技术涉及生物
，特别涉及针对绿色荧光蛋白(EGFP)纳米抗体的氨基酸序列、编码纳米抗体的核苷酸序列、能够表达所述纳米抗体的表达载体及宿主细胞。
技术介绍
绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein)最早是由下村修等人在1962年在一种学名Aequoreavictoria的水母中发现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色荧光。在细胞生物学与分子生物学领域中，绿色荧光蛋白基因常被用作为一个报告基因(reportergene)。EGFP(enhancedgreenfluorescentprotein),即增强绿色荧光蛋白。EGFP是GFP突变系，发射出的荧光强度比GFP大6倍以上，因此，比GFP更适合作为一种报告基因来研究基因表达、调控、细胞分化及蛋白质在生物体内定位和转运等。在生物学研究中，EGFP不仅只是光学上的指示蛋白，在蛋白纯化、外源基因在哺乳动物细胞中表达等方面，EGFP已成为重要的标签蛋白。这就使得针对EGFP的特异性抗体对基础生物医学研究十分重要。纳米抗体(variabledomainoftheheavychainofHCAbs,VHH)是一种天然缺失轻链的重链抗体可变区构成的小分子抗体(晶体结构直径2.5纳米，长度4纳米)，其最初是由比利时科学家在骆驼科动物体内发现。纳米抗体因其分子量小，具有亲和力高、稳定性强、组织相容性好及易筛选、易制备等特点，近年来在治疗型药物抗体、临床检测型抗体、科研运用型抗体等方面得到了广泛的研究与发展。纳米抗体的结构主要分为骨架区和互补决定区，前者在同源纳米抗体氨基酸序列中高度保守；主要负责纳米抗体基本结构的完整，后者主要针对不同的抗原出现复杂多样，其是抗原-抗体结合的决定区域。所以成功筛选的纳米抗体在于获得可以介导与抗原特异性结合的互补决定区。纳米抗体中的互补决定区(CDR)根据其在整个抗体中的位置不同，分为三个独立区域，即互补决定区1、互补决定区域2和互补决定区3。
技术实现思路
本专利技术的首要目的是提供一种增强绿色荧光蛋白(EGFP)纳米抗体，也可描述为针对EGFP的纳米抗体。本专利技术的第二个目的是提供一种EGFP纳米抗体互补决定区的编码序列。本专利技术的第三个目的是提供一种EGFP纳米抗体互补决定区的编码序列的表达载体。本专利技术的第四个目的是提供一种含有EGFP纳米抗体互补决定区的编码序列的表达载体的宿主细胞。为实现本专利技术的目的，提供如下的技术方案：本专利技术的一种增强绿色荧光蛋白(EGFP)纳米抗体，所述抗体在其互补决定区(CDR)1、互补决定区2及互补决定区3分别是含有SEQIDNO:1、SEQIDNO:2及SEQIDNO:3所示的氨基酸序列。本专利技术的一种增强绿色荧光蛋白纳米抗体的编码序列，其特征在于所述纳米抗体，在其互补决定区1、互补决定区2和互补决定区3分别含有SEQIDNO:4、SEQIDNO:5及SEQIDNO:6所示的核苷酸序列。具体来说，本专利技术的一种能够编码所述EGFP纳米抗体的CDR1-3区域的DNA序列，所述核苷酸序列为分别含有SEQIDNO:4、SEQIDNO:5及SEQIDNO:6所示的序列。本专利技术的一种表达载体，其特征在于所述载体含增强绿色荧光蛋白纳米抗体的CDR1-3区域的编码序列，所述CDR1-3区域的编码序列分别含有SEQIDNO:4、SEQIDNO:5及SEQIDNO:6所示的核苷酸序列。本专利技术的一种大肠杆菌宿主细胞，它含有一种表达载体，所述载体含增强绿色荧光蛋白纳米抗体的CDR1-3区域的编码序列，所述CDR1-3区域的编码序列分别含有SEQIDNO:4、SEQIDNO:5及SEQIDNO:6所示的核苷酸序列。本专利技术的EGFP纳米抗体互补决定区能够致使所构成的纳米抗体与EGFP蛋白发生良好的特异性结合。附图说明：图1表达载体pET28a-EGFP-FLAG构建流程图。图2含有空载体pET28a或重组质粒pET28a-EGFP-FLAG的表达菌株诱导表达蛋白后，先用结合FLAG标签蛋白磁珠纯化，再经FLAG多肽洗脱，最后用SDS-PAGE蛋白电泳分析。图3为纳米抗体表达载体pET28a-NB101-His和pET28a-NBcontrol-His构建流程图。图4为含有空载体pET28a及构建的pET28a-NB101-His和pET28a-NBcontrol-His重组质粒的表达菌株表达蛋白后，经His标签蛋白纯化磁珠纯化，SDS-PAGE蛋白电泳分析后的结果。图5为免疫共沉淀法分析纳米抗体NB101-His、NBcontrol-His与EGFP结合能力的结果。具体实施方式以下结合具体实施例对本专利技术作进一步的阐述。所举实例只用于解释或理解本专利技术的实质，并非用于限定本专利技术的范围。实施例1羧基端带有FLAG标签的EGFP重组蛋白的制备过程：(1)根据编码EGFP的基因序列(参照美国Clontech质粒pEGFP-C1中编码EGFP蛋白的核苷酸序列)，及FLAG标签序列(美国Sigma公司)，人工合成5’端和3’端分别带有Nco1和HindⅢ酶切位点的表达EGFP-FLAG重组蛋白的基因(苏州金唯智生物科技有限公司)，DNA序列如SEQIDNO:9所示,编码的氨基酸序列如SEQIDNO:10所示。(2)利用Nco1和HindⅢ双酶(购买于英国NewEnglandBiolabs)切获得酶切后的EGFP-FLAGDNA片段和pET28aDNA片段，将EGFP-FLAGDNA片段用T4连接酶(购买于英国NewEnglandBiolabs)连接至pET28a表达载体，经过基因序列测定，最终获得正确的pET28a-EGFP-FLAG表达载体。(见图1)(3)将表达载体pET28a-EGFP-FLAG和对照表达载体pET28a分别转入基因工程菌BL21(购自中国天根公司)，获得表达EGFP-FLAG重组蛋白的工程菌和对照菌，并分别接种至100mlLB培养基中，37℃，250转/分钟摇晃培养至培养液OD600值为0.6，加入IPTG(工作浓度为1mM)，然后在18℃，200转/分钟摇晃培养12h。培养结束后，收集细菌，按照FLAG标签蛋白纯化磁珠(美国Sigma公司)使用说明书，裂解细菌并纯化EGFP-FLAG。(4)将结合EGFP-FLAG磁珠至于含有FALG多肽(100ug/ml)的PBS溶液中，室温静置10min，进行EGFP-FLAG洗脱。然后收集洗脱液，用10Kda蛋白质超滤管过滤，去除FALG多肽。最后将EGFP-FLAG蛋白溶于PBS溶液。取5μlEGFP-FLAG蛋白溶液进行SDS-PAGE电泳分析。(见图2)实施例2针对EGFP的纳米抗体筛选过程：(1)包被抗原：按照PureCubeNHSActivatedMagBeads(德国cubebioteach公司)说明书，分别制备EGFP-FLAG蛋白和FALG多肽包被的磁珠。(2)纳米抗体库的预处理：取500μl含有2％(g/ml)脱脂奶粉PBS缓冲溶液(pH7.4)，加入非免疫美国骆驼(llama)纳米抗体噬菌体展示基因库(纳米抗体噬菌体展示基因库构建参照文献：GoldmanER,Ande本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种增强绿色荧光蛋白(EGFP)纳米抗体，其特征在于所述纳米抗体，在其互补决定区1、互补决定区2和互补决定区3分别含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种增强绿色荧光蛋白(EGFP)纳米抗体，其特征在于所述纳米抗体，在其互补决定区1、互补决定区2和互补决定区3分别含有SEQIDNO:1、SEQIDNO:2及SEQIDNO:3所示的氨基酸序列。2.一种权利要求1的增强绿色荧光蛋白纳米抗体的编码...
【专利技术属性】
技术研发人员：唐子执，张臣良，曾鸣，王小军，姜长安，
申请(专利权)人：成都吉罗克林生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51
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