浒苔来源的血管紧张素转化酶抑制肽及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了浒苔来源的血管紧张素转化酶抑制肽及其制备方法和应用，特点是抑制肽的氨基酸序列为SEQ ID NO1：Phe‑Gly‑Met‑Pro‑Leu‑Asp‑Arg和/或SEQ ID NO 2：Met‑Glu‑Leu‑Val‑Leu‑Arg，其制备方法包括制备浒苔粗蛋白的步骤；在浒苔粗蛋白溶液中添加胰蛋白酶酶解得到酶解产物的步骤；将酶解产物进行超滤分离后凝胶层析，收集含ACE抑制肽的第3个吸收峰组分的步骤；将含ACE抑制肽的组分进行凝胶层析，再采用高效液相色谱进行分离，收集含ACE抑制肽的第8个吸收峰组分得到抑制肽，优点是具有很强的降血压活性，安全性高，无毒副作用，易被人体吸收。

Angiotensin converting enzyme inhibitory peptides derived from Enteromorpha prolifera and their preparation and Application

The present invention discloses angiotensin converting enzyme inhibitory peptides from Enteromorpha prolifera and/or SEQ ID NO 2:Met_Glu_Leu_Arg and/or SEQ ID NO 2:Met_Glu_Leu_Arg, characterized by the amino acid sequence of inhibitory peptides being SEQ ID NO1:Phe_Gly_Met_Pro Leu_Asp Arg and/or SEQ ID NO 2:Met_Glu_Leu_Valu_Arg, and Suddenly, the hydrolysate was obtained by adding trypsin to the crude protein solution of Enteromorpha prolifera; the hydrolysate was separated by ultrafiltration followed by gel chromatography to collect the third absorption peak component containing ACE inhibitory peptide; the components containing ACE inhibitory peptide were separated by gel chromatography, and then separated by high performance liquid chromatography to collect the components containing ACE inhibitory peptide. Inhibitory peptides are obtained from the eighth absorption peak component of inhibitory peptides, which have the advantages of strong antihypertensive activity, high safety, non-toxic side effects and easy to be absorbed by the human body.

【技术实现步骤摘要】
浒苔来源的血管紧张素转化酶抑制肽及其制备方法和应用
本专利技术涉及一种血管紧张素转化酶抑制肽及其制备方法，尤其是涉及从大型海洋绿藻浒苔中分离纯化得到的具有血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性的海洋功能多肽及其制备方法和应用。
技术介绍
血管紧张素转化酶(Angiotensinconvertingenzyme，ACE)是一种锌金属蛋白酶，是肾素-血管紧张素系统中重要的蛋白酶之一。对人体血压调节有着重要的作用，通过作用于血管紧张素I的末端去掉His-Leu生成血管紧张素Ⅱ，它能够使动脉血管平滑肌收缩，迅速引起血压上升。抑制ACE活性是一种使血压下降的有效方法。当前治疗高血压的药物大多是化学合成品，存在一些不良反应，如咳嗽、味觉功能紊乱及皮疹等副作用。天然食源性ACE抑制肽具有安全性高、毒副作用小等优点，是新一代降压药物研发的重要方向。食品来源的ACE抑制剂由于其原料易得，一直受到人们的关注。海洋动物蛋白来源的降压肽也有报道，但海藻来源的ACI抑制剂还非常少，主要报道有刘淑集等利用坛紫菜(Porphyra)制备ACE抑制肽，其IC50值为0.67mg/mL，其多肽氨基酸结构也不确定（食品科学，2011，32(2)：213）；高冬芳等利用螺旋藻（Spirulina）制备ACE抑制肽，其IC50值为74.6μg/mL，但具体结构未知(食品科学，2011，32(7)：7)；。宁波大学从海洋微藻球等鞭金藻（Isochrysis）中分离纯化出的ACE降压肽，其结构为Tyr--Met-Gly-Leu-Asp-Leu-Lys（专利名称：一种海洋微藻来源的血管紧张素转化酶抑制肽，ZL201410172674.X），但是针对海藻来源的ACE抑制肽还比较少，很多由于多肽的一级结果无法确定，无法进一步应用。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种具有很强的降血压活性，安全性高，无毒副作用，易被人体吸收的浒苔来源的血管紧张素转化酶抑制肽及其制备方法和应用。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：浒苔来源的血管紧张素转化酶抑制肽，所述的抑制肽的氨基酸序列为SEQIDNO1：Phe-Gly-Met-Pro-Leu-Asp-Arg（FGMPLDR）和/或SEQIDNO2：Met-Glu-Leu-Val-Leu-Arg（MELVLR）。上述浒苔来源的血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法，包括以下步骤：（1）浒苔蛋白的制备：将新鲜浒苔按质量比1：3的比例加入到浓度为2.0wt%的氯化钠溶液中，捣碎后反复冻融，超声波提取，浸提过夜，8000r/min离心15min后；取上清液加入硫酸铵沉淀浓缩，离心后取沉淀复溶于蒸馏水，过0.45μm滤膜后用截留分子量为3500Da的透析袋于冰箱中避光透析48h，透析液冷冻干燥后得到浒苔粗蛋白，避光保存；（2）酶解：将步骤（1）得到的浒苔粗蛋白溶于水中配制成浓度为10-20g/mL的浒苔粗蛋白溶液，在浒苔粗蛋白溶液中添加浒苔粗蛋白质量2-6wt%的胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、α-糜蛋白酶或碱性蛋白酶进行水解，在pH为7.5-9.0，温度为22-42℃的条件下进行酶解，酶解时间为3-6h，酶解充分后100℃灭酶活15min，冰浴上冷却，于4℃，8000r/min冷冻离心15min，取上清液过0.45μm滤膜后，冷冻干燥得到酶解产物冻干粉；（3）分离：将步骤（2）得到的酶解产物冻干粉溶于水后配制成浓度为40mg/mL的上样液，用3000Da的超滤离心管进行超滤分离，将得到的MW＜3000Da组分进行SephadexG-25凝胶层析，340nm下检测肽的出峰位置，收集含ACE抑制肽的第3个吸收峰组分；（4）纯化和鉴定：将步骤（3）得到的含ACE抑制肽的组分进一步进行SephadexG-15凝胶层析，340nm下检测肽的出峰位置，收集含ACE抑制肽的第2个吸收峰组分；进一步采用高效液相色谱进行分离，收集含ACE抑制肽的第8个吸收峰组分，进一步对该组分进行LC-MS分离和De-Novo测序鉴定，得到两个纯的有较强ACE抑制活性的化合物，即浒苔来源的血管紧张素转化酶抑制肽，其氨基酸序列为SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示。步骤（2）具体为：将步骤（1）得到的浒苔粗蛋白溶于水中配制成浓度为15g/mL的浒苔粗蛋白溶液，在浒苔粗蛋白中添加浒苔粗蛋白质量4wt%的胰蛋白酶进行水解，在pH为8.0，温度为32℃的条件下进行酶解，酶解时间为5h，酶解充分后100℃灭酶活15min，冰浴上冷却，于4℃，8000r/min冷冻离心15min，取上清液过0.45μm滤膜，得到酶解产物。步骤（3）中SephadexG-25凝胶层析上样液用量为1mL，洗脱流速为0.25mL·min-1。步骤（4）中液相色谱条件为：色谱柱InertsilODS-3C18(10×250mm)，流动相A：含0.1%TFA的蒸馏水；流动相B：100%乙腈（含0.1%TFA）；洗脱条件：用流动A和B梯度洗脱65min（0-65min，0-50%B），流速1.5mL/min，检测波长220nm。上述浒苔来源的血管紧张素转化酶抑制肽在制备血管紧张素转化酶抑制剂方面的应用。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本专利技术首次公开浒苔来源的两个血管紧张素转化酶抑制肽及其制备方法，该多肽是从一种海洋大型绿藻浒苔（Ulvaintestinalis）中分离得到，这种大型绿藻是自然界生长的，每年在浙江宁波象山港沿海1-4月份大量繁殖，在6-9月份在青岛等地北方海域大量爆发，资源量非常丰富。获得的两个新结构的ACI抑制肽，其结构为Phe-Gly-Met-Pro-Leu-Asp-Arg（FGMPLDR，No.1)和Met-Glu-Leu-Val-Leu-Arg（MELVLR，No.2)，分子量分别为834.41和759.43，对应的IC50分别为219.35μM和236.85μM。食品来源的血管紧张素转化酶抑制剂的作用并非直接对血管起到降压作用，而是通过增加ACE2基因的表达，促进血管舒张达到降低血压的作用。综上所述，本专利技术从大型海藻浒苔中提取纯化出来的ACE抑制活性的多肽，具有很强的降血压活性，安全性高，无毒副作用，化合物分子量小易被人体吸收，而且来源广泛，具有重要的市场价值和应用前景。附图说明图1为不同酶胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、α-糜蛋白酶和碱性蛋白酶等水解产物对ACE抑制率的影响；图2为不同酶解pH对浒苔粗蛋白ACE抑制率的影响；图3为不同酶解温度对浒苔粗蛋白ACE抑制率的影响；图4为不同底物浓度对浒苔粗蛋白ACE抑制率的影响；图5为不同酶底比（E/S）对浒苔粗蛋白ACE抑制率的影响；图6为不同酶解时间对浒苔粗蛋白ACE抑制率的影响；图7为两个血管紧张素转化酶抑制肽的体内实验效果图。具体实施方式以下结合附图实施例对本专利技术作进一步详细描述。1、具体实施例浒苔来源的血管紧张素转化酶抑制肽，该抑制肽的氨基酸序列为SEQIDNO1：Phe-Gly-Met-Pro-Leu-Asp-Arg（FGMPLDR）和/或SEQIDNO2：Met-Glu-Leu-Val-Leu-Arg（MELVLR）。其制备方法包括以下步骤：（1）浒苔蛋白的制备：将新鲜浒苔按质量比1：3的比例本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.浒苔来源的血管紧张素转化酶抑制肽，其特征在于：所述的抑制肽的氨基酸序列为 SEQ ID NO1：Phe‑Gly‑Met‑Pro‑Leu‑Asp‑Arg和/或SEQ ID NO 2：Met‑Glu‑Leu‑Val‑Leu‑Arg。

【技术特征摘要】
1.浒苔来源的血管紧张素转化酶抑制肽，其特征在于：所述的抑制肽的氨基酸序列为SEQIDNO1：Phe-Gly-Met-Pro-Leu-Asp-Arg和/或SEQIDNO2：Met-Glu-Leu-Val-Leu-Arg。2.权利要求1所述的浒苔来源的血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）浒苔蛋白的制备：将新鲜浒苔按质量比1：3的比例加入到浓度为2.0wt%的氯化钠溶液中，捣碎后反复冻融，超声波提取，浸提过夜，8000r/min离心15min后；取上清液加入硫酸铵沉淀浓缩，离心后取沉淀复溶于蒸馏水，过0.45μm滤膜后用截留分子量为3500Da的透析袋于冰箱中避光透析48h，透析液冷冻干燥后得到浒苔粗蛋白，避光保存；（2）酶解：将步骤（1）得到的浒苔粗蛋白溶于水中配制成浓度为10-20g/mL的浒苔粗蛋白溶液，在浒苔粗蛋白溶液中添加浒苔粗蛋白质量2-6wt%的胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、α-糜蛋白酶或碱性蛋白酶进行水解，在pH为7.5-9.0，温度为22-42℃的条件下进行酶解，酶解时间为3-6h，酶解充分后100℃灭酶活15min，冰浴上冷却，于4℃，8000r/min冷冻离心15min，取上清液过0.45μm滤膜后，冷冻干燥得到酶解产物冻干粉；（3）分离：将步骤（2）得到的酶解产物冻干粉溶于水后配制成浓度为40mg/mL的上样液，用3000Da的超滤离心管进行超滤分离，将得到的MW＜3000Da组分进行SephadexG-25凝胶层析，340nm下检测肽的出峰位置，收集含ACE抑制肽的第3个吸收峰组分；（4）纯化和鉴定：将步骤（3）得到的含ACE抑制肽的...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐年军，孙雪，徐晓婷，操德群，李亚鹤，胡朝阳，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33