一种结球甘蓝与甘蓝型油菜的远缘杂交方法技术

本发明专利技术提供了一种结球甘蓝与甘蓝型油菜的远缘杂交方法，属于生物技术育种领域，本发明专利技术方法包括1)选择结球甘蓝胞质雄性不育系栽培种为母本，以甘蓝型油菜恢复系栽培种为父本，人工授粉后进行隔离；2)剪取授粉后15～18d的子房消毒；3)剥离消毒子房的胚珠，诱导培养至胚珠萌发；4)将萌发的胚珠分化培养，得F1代幼苗；5)分离F1代幼苗的侧芽，接种于生根培养基上，得完整杂交苗。本发明专利技术利用胚挽救技术克服了结球甘蓝与甘蓝型油菜栽培种远缘杂交时容易发生幼胚败育而无法获得杂种植株的问题，将油菜的优良恢复基因转入结球甘蓝胞质雄性不育栽培种中，恢复甘蓝的育性，为甘蓝的种质资源的创新与应用提供技术依据。

A distant hybridization method between cabbage and Brassica napus

The invention provides a distant hybridization method between heading cabbage and Brassica napus, which belongs to the field of biotechnology breeding. The method comprises the following steps: 1) selecting the heading cabbage cytoplasmic male sterile line as the female parent, taking the restorer line as the male parent, and isolating the restorer line after artificial pollination; Ovary disinfection; 3) exfoliate ovules from sterilized ovaries and induce them to germinate; 4) differentiate the germinated ovules into F1 seedlings; 5) isolate lateral buds of F1 seedlings and inoculate them on rooting medium to obtain complete hybrid seedlings. The invention overcomes the problem that immature embryo abortion is easy to occur in distant hybridization between heading cabbage and Brassica napus cultivars and hybrid plants can not be obtained by using embryo rescue technology, and transfers the excellent restoring gene into the heading cabbage cytoplasmic male sterility cultivars to restore the fertility of the cabbage, which is an innovation of the germplasm resources of the cabbage. Application provides technical basis.

【技术实现步骤摘要】
一种结球甘蓝与甘蓝型油菜的远缘杂交方法
本专利技术属于生物技术育种领域，具体涉及一种结球甘蓝与甘蓝型油菜的远缘杂交方法。
技术介绍
结球甘蓝(BrassicaoleraceaL.var.capitataL.，2n＝18)简称甘蓝，属十字花科芸薹属甘蓝种，是我国重要的蔬菜作物，在全国各地均有栽培，年栽培面积达到9×105hm2左右。甘蓝的杂种优势比较明显。Ogura细胞质雄性不育系的材料表现为母体遗传、花粉败育和雌蕊正常，容易被恢复系材料的显性核恢复基因恢复育性，但无法进行正常的自交分离和进一步种质资源的创新。结球甘蓝和甘蓝型油菜都是十字花科中的重要栽培作物，该油菜材料又为恢复系材料，结球甘蓝和甘蓝型油菜远缘杂交，大大促进两种作物间的优异基因交流，将油菜的恢复系基因转到结球甘蓝雄性不育系材料上，恢复甘蓝的育性，为甘蓝的遗传育种与种质资源的创新奠定了基础。但两者由于受精后杂种胚、胚乳和子房之间缺乏协调性，导致幼胚不发育或中途停止发育，是远缘杂交育种工作的瓶颈。在十字花科蔬菜育种过程中胚挽救技术虽有一些报道。例如：Diederichsen.采用远缘杂交结合胚挽救技术获得了西兰花与大白菜杂交的F1代，连续回交之后将A基因组CR基因转移到C基因组中。Snowdon等将抗黑胫病基因从白芥转移到了甘蓝型油菜；胡大为等以黑芥为母本、诸葛菜为父本的正交组合获得了1株真杂种；李俊等以白菜和芥蓝进行正反杂交，研究结果显示，白菜×芥蓝的平均杂种获得率(2.32％)；但到目前为止，国内外几乎没有利用幼胚挽救离体培养技术实现亲缘关系相对较远的十字花科结球甘蓝与甘蓝型油菜种间杂交并获得杂交后代植株的案例，而且培养周期长、技术复杂。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种结球甘蓝与甘蓝型油菜的远缘杂交方法，克服甘蓝与甘蓝型油菜栽培种远缘杂交时容易发生幼胚败育而无法获得杂种植株的问题，将油菜的优良恢复基因转入结球甘蓝胞质雄性不育栽培种中，恢复甘蓝的育性。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种结球甘蓝与甘蓝型油菜的远缘杂交方法，包括以下步骤：1)选择结球甘蓝胞质雄性不育系栽培种为母本，以甘蓝型油菜恢复系栽培种为父本，人工授粉后进行隔离；2)剪取步骤1)所述人工授粉后15～18d的子房，消毒后得消毒子房；3)剥离步骤2)所述消毒子房的胚珠接种于诱导培养基上诱导培养8～12d，得萌发的胚珠；所述诱导培养基以MS为基本培养基，还包括0.1～0.5mg/L的GA、0.1～0.5mg/L的NAA、25～35g/L的蔗糖、6～10g/L的琼脂、0.2～1％的活性炭和最终质量浓度为0.3～1.2％的水解酪蛋白，pH值为5.5～6.5；4)将步骤3)所述萌发的胚珠接种于分化培养基上分化培养7～14d，得F1代幼苗；所述分化培养基以MS为基本培养基，还包括0.2～0.8mg/L的6-BA、20～35g/L的蔗糖和6～10g/L的琼脂，pH值为5.8；5)分离步骤4)所述F1代幼苗的侧芽，接种于生根培养基上生根培养6～14d，得完整杂交苗；所述生根培养基以MS为基本培养基，还包括0.05～0.15mg/L的NAA、20～35g/L的蔗糖和6～8g/L的琼脂，pH值为5.8。优选的，步骤1)所述母本为秦甘58，父本为RFO-46。优选的，步骤1)所述人工授粉，包括：杂交前2～3d摘除母本已开放的花朵，对未开放花朵挂牌并套袋隔离；取套袋父本开花当天花药，对母本花蕾进行剥蕾授粉，授粉后套袋隔离。优选的，步骤2)所述消毒，包括乙醇浸泡10～50s后升汞消毒10～30min。优选的，步骤3)所述诱导培养的条件包括：温度22～26℃，光照强度1100～2000lux，光照10～14h/d。优选的，步骤4)所述分化培养的条件包括：26～30℃，光照强度1100～2000lux，光照10～14h/d。优选的，步骤5)所述生根培养的条件包括：25～27℃，光照强度1500～2000lux，光照10～12h/d。优选的，步骤5)得到所述完整杂交苗后，还包括炼苗、移栽。优选的，所述炼苗的方法包括将所述完整杂交苗置于室内自然光下培养1～4d。优选的，所述移栽的基质包括体积比为(4～8):1:(1～5)的泥炭、珍珠岩和硅石。本专利技术提供了一种结球甘蓝与甘蓝型油菜的远缘杂交方法，利用胚挽救的方式克服了结球甘蓝和甘蓝型油菜远缘杂交时由于染色体数目、结构不对等，受精后杂种胚、胚乳和子房之间缺乏协调性，导致幼胚不发育或中途停止发育无法获得杂一代植株的问题，同时甘蓝型油菜含有恢复系基因，将其转到结球甘蓝雄性不育材料上，恢复结球甘蓝的育性；选择授粉15～18d的幼胚培养，可大大提高出胚率，获得92.73％的杂种后代。附图说明图1为添加杂交授粉套袋隔离图；图2为胚珠离体诱导直接萌发成幼苗图；图3为亲本与杂交种F1代植株叶型对比图，其中3-1-1、3-1-2为结球甘蓝，3-2-1、3-2-2为杂交种F1代，3-3-1、3-3-2为甘蓝型油菜；图4为花朵对比图，4-1为结球甘蓝，4-2为杂交种F1代，4-3为甘蓝型油菜；图5为亲本与杂交种F1代植株的流式细胞仪检测结果图，其中A为结球甘蓝，B为甘蓝型油菜，C为杂交种F1代；图6为亲本与杂种植物的SSR标记鉴定电泳图，其中M1、M2为DNAMarker，1～4为结球甘蓝，5～7为甘蓝型油菜，8～35为杂交种F1代。具体实施方式本专利技术提供了一种结球甘蓝与甘蓝型油菜的远缘杂交方法，包括以下步骤：1)选择结球甘蓝胞质雄性不育系栽培种为母本，以甘蓝型油菜恢复系栽培种为父本，人工授粉后进行隔离；2)剪取步骤1)所述人工授粉后15～18d的子房，消毒后得消毒子房；3)剥离步骤2)所述消毒子房的胚珠接种于诱导培养基上诱导培养8～12d，得萌发的胚珠；所述诱导培养基以MS为基本培养基，还包括0.1～0.5mg/L的GA、0.1～0.5mg/L的NAA、25～35g/L的蔗糖、6～10g/L的琼脂、0.2～1％的活性炭和最终质量浓度为0.3～1.2％的水解酪蛋白，pH值为5.5～6.5；4)将步骤3)所述萌发的胚珠接种于分化培养基上分化培养7～14d，得F1代幼苗；所述分化培养基以MS为基本培养基，还包括0.2～0.8mg/L的6-BA、20～35g/L的蔗糖和6～10g/L的琼脂，pH值为5.8；5)分离步骤4)所述F1代幼苗的侧芽，接种于生根培养基上生根培养6～14d，得完整杂交苗；所述生根培养基以MS为基本培养基，还包括0.05～0.15mg/L的NAA、20～35g/L的蔗糖和6～8g/L的琼脂，pH值为5.8。本专利技术选择结球甘蓝胞质雄性不育系栽培种为母本，以甘蓝型油菜恢复系栽培种为父本，人工授粉后进行隔离。在本专利技术中，所述结球甘蓝胞质雄性不育系栽培种优选的为结球甘蓝Ogura胞质雄性不育系栽培种，更优选的为秦甘58(2n＝2x＝18)。本专利技术对母本甘蓝雄性不育系材料的来源没有特殊限定，优选来源于西北农林科技大学园艺学院种子库，公众可以得到。本专利技术对父本甘蓝型油菜恢复系栽培种的品种及来源没有特殊限定，优选来源于陕西省杂交油菜研究中心种子库，公众可以得到。本专利技术所述人工授粉，优选的包括：杂交前2～3d摘除母本已开放的花朵，对未本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种结球甘蓝与甘蓝型油菜的远缘杂交方法，包括以下步骤：1)选择结球甘蓝胞质雄性不育系栽培种为母本，以甘蓝型油菜恢复系栽培种为父本，人工授粉后进行隔离；2)剪取步骤1)所述人工授粉后15～18d的子房，消毒后得消毒子房；3)剥离步骤2)所述消毒子房的胚珠接种于诱导培养基上诱导培养8～12d，得萌发的胚珠；所述诱导培养基以MS为基本培养基，还包括0.1～0.5mg/L的GA、0.1～0.5mg/L的NAA、25～35g/L的蔗糖、6～10g/L的琼脂、0.2～1％的活性炭和最终质量浓度为0.3～1.2％的水解酪蛋白，pH值为5.5～6.5；4)将步骤3)所述萌发的胚珠接种于分化培养基上分化培养7～14d，得F1代幼苗；所述分化培养基以MS为基本培养基，还包括0.2～0.8mg/L的6‑BA、20～35g/L的蔗糖和6～10g/L的琼脂，pH值为5.8；5)分离步骤4)所述F1代幼苗的侧芽，接种于生根培养基上生根培养6～14d，得完整杂交苗；所述生根培养基以MS为基本培养基，还包括0.05～0.15mg/L的NAA、20～35g/L的蔗糖和6～8g/L的琼脂，pH值为5.8。

【技术特征摘要】
1.一种结球甘蓝与甘蓝型油菜的远缘杂交方法，包括以下步骤：1)选择结球甘蓝胞质雄性不育系栽培种为母本，以甘蓝型油菜恢复系栽培种为父本，人工授粉后进行隔离；2)剪取步骤1)所述人工授粉后15～18d的子房，消毒后得消毒子房；3)剥离步骤2)所述消毒子房的胚珠接种于诱导培养基上诱导培养8～12d，得萌发的胚珠；所述诱导培养基以MS为基本培养基，还包括0.1～0.5mg/L的GA、0.1～0.5mg/L的NAA、25～35g/L的蔗糖、6～10g/L的琼脂、0.2～1％的活性炭和最终质量浓度为0.3～1.2％的水解酪蛋白，pH值为5.5～6.5；4)将步骤3)所述萌发的胚珠接种于分化培养基上分化培养7～14d，得F1代幼苗；所述分化培养基以MS为基本培养基，还包括0.2～0.8mg/L的6-BA、20～35g/L的蔗糖和6～10g/L的琼脂，pH值为5.8；5)分离步骤4)所述F1代幼苗的侧芽，接种于生根培养基上生根培养6～14d，得完整杂交苗；所述生根培养基以MS为基本培养基，还包括0.05～0.15mg/L的NAA、20～35g/L的蔗糖和6～8g/L的琼脂，pH值为5.8。2.根据权利要求1所述的远缘杂交方法，其特征在于，步骤1)所述母本为秦甘58，父本为RFO-46。3.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：许忠民，王杏利，张恩慧，姜娇，李升娟，郭佳，马青山，石汶汶，吴晓凤，董艺，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61