一种特异性分离富集磷酸化肽和糖基化肽的方法技术

本发明专利技术提出一种特异性分离富集磷酸化肽和糖基化肽的方法，具体步骤如下，将亲水性磁性介孔二氧化钛材料配置成分散液，和目标糖基化肽段和磷酸化肽段溶液加入上样缓冲液中，37℃下孵育30‑60分钟，用上样缓冲液洗涤材料，以体积比5‑20%氨水作为洗脱缓冲液，将洗脱液点靶，进行质谱分析。本发明专利技术通过控制富集及洗脱条件实现对低丰度糖基化肽及磷酸化肽的同时富集，结合MALDI‑TOF MS或者nano‑LC‑MS/MS能够实现同时大规模鉴定糖基化蛋白质和磷酸化蛋白质，在翻译后修饰蛋白质组学中具有广阔的应用前景。

A specific method for isolation and enrichment of phosphopeptides and glycosylated peptides

The present invention provides a specific method for separating and enriching phosphopeptides and glycosylated peptides. The specific steps are as follows: the hydrophilic magnetic mesoporous titanium dioxide material is disposed with component dispersions, the target glycosylated peptides and phosphorylated peptides are added into the sample buffer solution, incubated at 37 C for 30_ 60 minutes, and the material is washed with the sample buffer solution. The eluent was used as an eluent buffer with a volume ratio of 5 ~ 20% ammonia water, and the eluent was used for target mass analysis. The invention can simultaneously enrich low-abundance glycosylated and phosphorylated peptides by controlling enrichment and elution conditions, and can simultaneously identify glycosylated and phosphorylated proteins on a large scale by combining MALDI TOF MS or nano LC MS/MS. The method has broad application prospects in post-translational modified proteomics.

【技术实现步骤摘要】
一种特异性分离富集磷酸化肽和糖基化肽的方法
本专利技术属于新型纳米介孔吸附材料的制备，具体涉及一种特异性分离富集磷酸化肽和糖基化肽的方法，尤其涉及一种基于亲水性磁性介孔二氧化钛纳米材料选择性富集提纯糖基化肽和磷酸化肽的方法。
技术介绍
蛋白质的糖基化和磷酸化均属最重要的蛋白质翻译后修饰方式之一，在诸如蛋白质折叠、细胞信号传导、细胞分化等众多生物过程中扮演着极其重要的角色，因而受到了研究者们的广泛关注。研究表明，蛋白质的糖基化程度及糖链组成、结构的异常变化与很多癌症及其他疾病都密切相关，而糖基化蛋白质又普遍存在于细胞外环境中，在诊疗过程中最易获得，因而经常被作为疾病标志物来研究。蛋白质的可逆磷酸化因参与了几乎所有的生命活动被形象地称为细胞生理活动的分子开关。因此，为了深入研究蛋白质的糖基化和磷酸化，首先要将低丰度的修饰肽从复杂、高丰度的非糖基化、磷酸化肽中分离富集出来。近年来，研究者们发展了多种糖基化肽段和磷酸化肽的分离富集方法。糖基化肽段的富集方法主要有亲水作用法、硼酸化学法和肼化学法等等，其中，亲水相互作用具有众多优点，如重复性好，对不同糖型的糖肽均展现优异的富集性能，与质谱兼容性好等等。而针对磷酸化肽段的富集使用最多的是固定化金属亲和色谱法和金属氧化物亲和色谱法，二氧化钛纳米材料因其富集磷酸化肽展现出的高特异性和高选择性而受到广泛关注。目前已有许多纳米材料被合成以用于糖基化肽段或磷酸化肽段的分离富集中，但因比表面积小、功能分子负载量少等缺点而无法展现出更优异的富集性能，同时能够针对少量样品同时富集糖基化肽段和磷酸化肽段的材料也十分少见。
技术实现思路
本专利技术提出了一种特异性分离富集磷酸化肽和糖基化肽的方法，首次合成了具有强磁响应性的亲水性介孔二氧化钛材料并将其用于糖基化肽段和磷酸化肽段的分离纯化中。在外加磁场的作用下，捕获了糖基化肽段和磷酸化肽段的亲水性磁性介孔二氧化钛材料可以快速地从复杂样品溶液中分离开来，使整个富集、洗脱过程所需时间大大缩短。同时，亲水性磁性介孔二氧化钛材料的介孔层的存在使材料具有良好的体积排阻能力。本专利技术目的在于提供一种亲水性磁性介孔二氧化钛材料的合成方法及其在糖基化肽段和磷酸化肽段的富集纯化中的应用。本专利技术提供的一种特异性分离富集磷酸化肽和糖基化肽的方法，具体步骤如下，将亲水性磁性介孔二氧化钛材料与上样缓冲液配置成材料分散液，将该分散液和目标糖基化肽段和磷酸化肽段溶液加入上样缓冲液中，上样缓冲液为含有体积占85%-95%的乙腈和体积占0.1-5%的三氟乙酸缓冲溶液，37℃下孵育30-60分钟，用上样缓冲液洗涤材料，以体积浓度5-20%的氨水作为洗脱缓冲液，将洗脱液点靶，进行质谱分析。本专利技术中，所述亲水性磁性介孔二氧化钛材料的合成方法，具体步骤如下：（1）将六水合三氯化铁溶解于乙二醇中，至溶液澄清透明后加入无水醋酸钠，经充分搅拌超声后转移至反应釜中，在100-400℃下加热8-20小时，反应完毕后待反应釜冷却至室温，用去离子水和无水乙醇充分洗涤所得产物，于40-75℃下真空干燥；（2）将步骤（1）所得产物均匀分散于溶剂中，加入碱和二氧化钛前驱体，将所得混合溶液在20-80℃搅拌反应12-48小时，用去离子水和无水乙醇充分洗涤；（3）将步骤（2）所得产物均匀分散于溶剂后转移至水热反应釜中，在60-200℃下加热6-24小时，反应完毕后待反应釜冷却至室温，用无水乙醇充分洗涤所得产物，于40-75℃下真空干燥；（4）将步骤（3）所得产物在空气中200-800℃下煅烧1-10小时；（5）将步骤（4）所得产物均匀分散于含有巯基苹果酸的溶剂中，20-80℃下反应6-24小时，所得产物用去离子水和无水乙醇充分洗涤后于40-75℃下真空干燥，即得所述亲水性磁性介孔二氧化钛材料。本专利技术中，步骤（2）中的溶剂为乙醇，去离子水或乙醇/水混合溶液。本专利技术中，步骤（2）中的碱为氢氧化钠、碳酸钠、氢氧化钙或氨水中的一种或几种。本专利技术中，步骤（2）中二氧化钛前驱体为钛酸四异丙酯、钛酸正丁酯或钛酸四乙酯中的一种或多种。本专利技术中，步骤（2）中步骤（1）所得产物与二氧化钛前驱体的质量比为40:1-10:1。本专利技术中，步骤（3）中溶剂为无水乙醇，去离子水或氨水中的一种或几种。本专利技术中，步骤（5）中溶剂为甲醇、乙醇或去离子水中的一种或几种。本专利技术中，步骤（5）中步骤（4）所得产物与巯基苹果酸的质量比为20:1-1:50。本专利技术所述的特异性分离富集磷酸化肽和糖基化肽的方法具有如下优点：1.亲水性磁性介孔二氧化钛纳米材料具有大比表面积，良好的磁响应性和亲水性，与糖肽和磷酸化肽具有强烈相互作用，可以更灵敏、更有选择性地分离富集糖肽和磷酸化肽。2.亲水性磁性介孔二氧化钛纳米材料的介孔结构有益于目标糖基化肽段和磷酸化肽的捕获，使该材料在复杂的生物样品中显示出对糖肽和磷酸化肽良好的富集能力。3.亲水性磁性介孔二氧化钛纳米材料应用于蛋白质翻译后修饰研究中，通过亲水相互作用及金属氧化物亲和色谱法可以同时富集纯化糖肽和磷酸化肽两种翻译后修饰肽段，结合nano-LCMS/MS可以大规模鉴定糖基化蛋白质和磷酸化蛋白质并确定糖基化位点和磷酸化位点。附图说明图1为实施例1的亲水性磁性介孔二氧化钛材料的扫描电子显微镜照片；图2为实施例1的亲水性磁性介孔二氧化钛材料的透射电子显微镜照片；图3为实施例1的亲水性磁性介孔二氧化钛材料的氮气吸附等温线以及孔径分布图；图4为实施例2的亲水性磁性介孔二氧化钛材料对标准糖基化蛋白HRP酶解液中糖肽分离富集的质谱图。图A为未经富集的HRP糖基化肽段的质谱图，图B为本材料富集后HRP糖基化肽段的质谱图。图5为实施例3的亲水性磁性介孔二氧化钛材料对标准磷酸化蛋白β-casein酶解产物中磷酸化肽分离富集的质谱图。图A为未经富集的β-casein磷酸化肽的质谱图，图B为本材料富集β-casein后磷酸化肽的质谱图。图6为实施例4的亲水性磁性介孔二氧化钛材料对HRP和β-casein酶解产物中糖肽和磷酸化肽同时富集的质谱图。图A为未经富集的HRP和β-casein混合酶解产物的质谱图，图B为使用磁性介孔二氧化钛材料富集HRP和β-casein混合酶解产物的质谱图，图C为本材料富集HRP和β-casein混合酶解产物后糖肽和磷酸化肽的质谱图。图7为实施例5的亲水性磁性介孔二氧化钛材料富集HRP和β-casein混合酶解产物中糖肽和磷酸化肽重复性的质谱图。图A为本材料第一次富集后糖肽和磷酸化肽的质谱图，图B为本材料第三次富集后糖肽和磷酸化肽的质谱图，图C为本材料第五次富集后糖肽和磷酸化肽的质谱图。具体实施方式本专利技术利用亲水性磁性介孔二氧化钛材料与糖基化肽和磷酸化肽的相互作用实现对两种翻译后修饰肽段的同时富集，以下介绍具体实施方式。实施例1：亲水性磁性介孔二氧化钛材料的合成（1）将1.35gFeCl3·6H2O在75mL乙二醇中经磁力搅拌至溶液澄清后，加入3.6gNaAc，再经充分搅拌超声后转移至水热反应釜中，200℃下加热12小时，待反应釜冷却后，用去离子水和乙醇分别洗涤产物三次，50℃下真空干燥；（2）将（1）中所得产物50mg超声分散于含4ml氨水的400ml乙醇中，逐滴滴加2.5ml钛酸正丁酯，将所得混合溶液本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种特异性分离富集磷酸化肽和糖基化肽的方法，其特征在于具体步骤如下：将亲水性磁性介孔二氧化钛材料与上样缓冲液配置成材料分散液，将该材料分散液和目标糖基化肽段以及磷酸化肽段溶液加入到上样缓冲液中，上样缓冲液为含有体积占85%‑95% 的乙腈和体积占0.1‑5% 的三氟乙酸缓冲溶液，37℃下孵育30‑60分钟，用上样缓冲液洗涤材料，以体积浓度5‑20% 的氨水作为洗脱缓冲液，将洗脱液点靶，进行质谱分析。

【技术特征摘要】
1.一种特异性分离富集磷酸化肽和糖基化肽的方法，其特征在于具体步骤如下：将亲水性磁性介孔二氧化钛材料与上样缓冲液配置成材料分散液，将该材料分散液和目标糖基化肽段以及磷酸化肽段溶液加入到上样缓冲液中，上样缓冲液为含有体积占85%-95%的乙腈和体积占0.1-5%的三氟乙酸缓冲溶液，37℃下孵育30-60分钟，用上样缓冲液洗涤材料，以体积浓度5-20%的氨水作为洗脱缓冲液，将洗脱液点靶，进行质谱分析。2.一种特异性分离富集磷酸化肽和糖肽的方法，其特征在于，所述亲水性磁性介孔二氧化钛材料的合成方法，具体步骤如下：（1）将六水合三氯化铁溶解于乙二醇中，至溶液澄清透明后加入无水醋酸钠，经充分搅拌超声后转移至反应釜中，在100-400℃下加热8-20小时，反应完毕后待反应釜冷却至室温，用去离子水和无水乙醇充分洗涤所得产物，于40-75℃下真空干燥；（2）将步骤（1）所得产物均匀分散于溶剂中，加入碱和二氧化钛前驱体，将所得混合溶液在20-80℃搅拌反应12-48小时，用去离子水和无水乙醇充分洗涤；（3）将步骤（2）所得产物均匀分散于溶剂后转移至水热反应釜中，在60-200℃下加热6-24小时，反应完毕后待反应釜冷却至室温，用无水乙醇充分洗涤所得产物，于40-75℃下真空干燥；（4）将步骤（3）所得产物在空气中200-800℃下煅烧1-10小时；（5）将步骤（4）...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓春晖，王嘉雯，姚继宗，孙念荣，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海,31