一种利用磁珠提取和纯化抗体的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用磁珠提取和纯化抗体的方法，该方法包括：准备杂交瘤细胞上清液于烧杯中；向上清液中加入磁珠，其中，上清液的体积与磁珠的比例为：20毫克磁珠对应100毫升的上清液；将烧杯放在磁力架上进行抗体的磁珠吸附，10min后取出磁珠，晾干后，用乙醇进行洗涤多次，然后，用0.1M甘氨酸，pH 3.0洗脱磁珠上的抗体，洗脱的次数是这样的：首先用50微升的0.15M NaCl,20mM Na2HPO4,pH7.0的缓冲液洗脱磁珠一次，洗脱液丢弃，然后，再用0.1M甘氨酸，pH 3.0洗脱磁珠，每次使用50微升进行洗脱，收集洗脱液为目标抗体溶液。该方法操作简单快捷。

A method of extracting and purifying antibodies by magnetic beads

The present invention discloses a method for extracting and purifying antibodies using magnetic beads. The method includes: preparing hybridoma cell supernatant in a beaker, adding magnetic beads to the supernatant, in which the volume of the supernatant is proportional to the magnetic bead, the 20 mg magnetic bead corresponds to the 100 ml supernatant; the beaker is placed on the magnetic frame for the antibody. Magnetic beads adsorb, after 10min remove the magnetic beads, dry after washing with ethanol a number of times, and then use 0.1M glycine, pH 3 to elute the magnetic beads on the antibody, the number of elution is such: first use 50 microl NaCl, 20mM Na2HPO4, pH7.0 buffer liquid eluting magnetic beads once, eluant discard, and then 0.1M Gan ammonia Acid, pH 3 eluted magnetic beads were eluted at each 50 microl and the eluent was collected as the target antibody solution. This method is simple and quick to operate.

【技术实现步骤摘要】
一种利用磁珠提取和纯化抗体的方法
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种磁珠法产菌核真菌蛋白质提取试剂盒，以及特异性强快速提取产菌核真菌蛋白质的方法，特别地，属于纯化抗体的方法。
技术介绍
菌核是由菌丝紧密连接交织而成的休眠体，其功能主要是抵御不良环境。常见的产菌核真菌有菌核属和丝核菌属真菌，该类真菌含有大量的胞外多糖。而真菌胞外多糖具有高吸附高粘稠特点，是困扰产菌核真菌分离提取高纯度蛋白质的难点之一。由于基因组学本身的局限性，科学家们又进一步提出了蛋白质组学研究。蛋白质的分离纯化是现代分子生物学的一项基本技术，同时也是研究蛋白质组学的重要手段，而高质量的细胞总蛋白，在蛋白质组研究中才能避免失去一些有价值、有意义的低丰度蛋白质，而这些低丰度蛋白质往往是机制调节中的关键蛋白质，因此一种高效的总蛋白质提取方法对于进行蛋白质组的研究具有十分重要的作用。蛋白质提取与制备蛋白质种类很多，性质上的差异很大，既或是同类蛋白质，因选用材料不同，使用方法差别也很大,且又处于不同的体系中，因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离，但多数分离工作中的关键部分基本手段还是共同的。大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质和酶、蛋白质与酶在不同溶剂中溶解度的差异，主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例，其次取决于这些基团的排列和偶极矩。故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因，温度、pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用，将细胞内蛋白质提取出来，并与其它不需要的物质分开，从而达到蛋白质的分离。虽然蛋白质提取的方法由很多，但是针对产菌核类真菌的蛋白质提取有很大的弊端，在提取过程真菌本身含有的多糖严重影响了蛋白质分离，使得到蛋白质提取物浓度太低，下游试验常常失败。近年来，因纳米磁性氧化铁的特殊性，磁珠法在真菌蛋白质提取应用中越来越受到关注。其原理为磁珠表面修饰有特殊化学基团或者依靠巨大的表面能，可在不同条件下对蛋白质分子形成特异性吸附和解吸附作用，吸附在磁珠内的蛋白质分子在外加磁场作用下可与磁珠分离，简单便捷的完成蛋白质的提取工作。虽然磁珠法大部分真菌蛋白质提取的操作简便，其不足之处也是无法排除多糖物质对蛋白质吸附的影响。另外，对于生物体的蛋白质提取，虽然具有很多经典的方法，但是，这些传统的方法不能日益满足一些测试的需要，有些测试需要纯度很高的蛋白质，而不希望含有任何其它杂质，例如RNA、DNA或者多糖等物质，因为这些物质会对测试产生干扰。有时候，尽管样本中具有蛋白质，但是浓度仍达不到下游试验的要求，这可能是含有的杂质对测试系统干扰造成的，虽然这些杂质含量很少，但是仍然会对检测结果造成干扰，有的时候，因提取过程中蛋白质水解，浓度较低，甚至让检测失败。这就需要对传统的方法进行改进，期望获得高纯度的蛋白质而不含有杂质，且使蛋白质水解率降低。另外,对于抗体的纯化,也是一件耗时耗财的事情,常常需要耗费大量的材料来对抗体的提纯，在提纯过程中会造成大量抗体的浪费，有时候提取抗体，还需要耗费很长时间。这是因为，抗体是属于一种特殊的蛋白，在纯化的过程中，首先要出去非蛋白的杂质，然后再提取目标抗体，而去除哪些杂蛋白，这些会影响提取的步骤和时间。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种磁珠法产菌核真菌蛋白质提取试剂盒。该试剂盒可以有效除去样本溶液中的杂质而特异吸附蛋白质，使获得的蛋白质的纯度达到99％以上。特别的，对磁珠采用特殊试剂进行处理，可以让磁珠只特异吸附蛋白质，而不会吸附其它杂质，例如DNA、RNA或者其它杂质。这里所说的特异是可以吸附99.9％的蛋白质，而不会或者几乎很少吸附其它非蛋白质的物质，例如DNA或者RNA，或者多糖。或者这里吸附抗体，而不吸附其它杂质。这种处理磁珠的试剂包括环氧氯丙烷溶液和4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐，然后再用处理过的磁珠来吸附样本中的蛋白质，意外的发现蛋白质或者抗体的纯度可以显著提高。环氧氯丙烷一种有机化合物，主要用途是用于制环氧树脂，也是一种含氧物质的稳定剂和化学中间体，他的处理，可能对磁珠环氧基化，使磁珠的表面吸附能力增强。4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐是一种新型蛋白质酶抑制剂，可以抑制多种蛋白质酶活性，保证提取的蛋白质不被水解，使蛋白质水解率降低。因此相对传统的常规提取蛋白质的纯度，具有显著的提高。在一些方式中，本专利技术提供一种磁珠法产菌核真菌蛋白质提取试剂盒，其特征在于包括：溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和磁珠悬浮液；所述磁珠悬浮液包括：磁珠材质为纳米磁性氧化铁，直径为1.2-2mm；所述溶液Ⅰ由Tris-HCl、EDTA、TritonX-100、β-巯基乙醇、苯甲基磺酰氟和LiCl组成，pH值为7.5；所述溶液Ⅱ为异丙醇。其中，所述的磁珠经过如下处理步骤处理：磁珠在氧氯丙烷溶液进行浸泡5-6小时，同时红外线照射，取出的环氧基化的磁珠用PBS缓冲液(pH＝7.0)冲洗5-8次，将取出的磁珠再浸入4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐溶液2-3小时，PBS缓冲液冲洗5-8次后备用。作为优选的方案，所述的氧氯丙烷溶液的浓度为8mol/L，4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐溶液的浓度为6mol/L。另一方面，一种磁珠法产菌核真菌DNA提取的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：步骤一：在无菌条件下将培养好的立枯丝核菌的菌核夹取至1.5ml离心管中，菌核质量不小于300mg，用液氮进行冷冻研磨至粉末状，加入300μL溶液Ⅰ，再加入50μLRNase，震荡混匀；步骤二：4℃12000rpm离心1min，取上清至新管中；步骤三：加入300μL溶液Ⅱ，轻轻上下翻动5-6次；步骤六：加入50μL磁珠悬浮液，轻轻上下翻动后在冰上静置10min；步骤七：将离心管放置于磁力架上，静置1min使溶液变透明，弃溶液；步骤八：打开离心管盖，室温静置3-5min，使磁珠表面的试剂尽量挥发掉后加入50μL去离子水，静置2min后使用移液器将含有蛋白质的溶液至新管，放置于-20℃备用。所述溶液Ⅰ中Tris-HCl浓度为10mmol/L，EDTA浓度为10mmol/L，0.5％TritonX-100，0.07％β-巯基乙醇，苯甲基磺酰氟浓度为10mmol/L、LiCl溶液浓度为8mol/L；所述溶液Ⅱ中异丙醇浓度为99％。优选的，所述溶液Ⅰ中苯甲基磺酰氟需要异丙醇溶液配制，异丙醇浓度为90％。优选的，所述的氧氯丙烷溶液的浓度为8mol/L，4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐溶液的浓度为6mol/L。优选的，所述的氧氯丙烷溶液和4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐溶液的体积比为1:1。优选的，其中，还包括对步骤七之后的对磁珠吸附的蛋白质步骤：打开离心管盖，室温静置3-5min，使磁珠表面的异丙醇尽量挥发掉后加入50μL去离子水，静置2min后使用移液器将含有蛋白质的溶液至新管。在一些优选的方式中，对样本中颗粒较大的物质进行过滤去除，或者对一些含量高的物质，例如多糖进行初步去除，然后再加入处理过的磁珠进行吸附，发现该磁珠仅仅吸附样本中的蛋白质，而不会吸附样本中的其它物质，例如RNA、DNA或本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用磁珠提取和纯化抗体的方法，该方法包括：准备杂交瘤细胞上清液于烧杯中；向上清液中加入磁珠，其中，上清液的体积与磁珠的比例为：20毫克磁珠对应100毫升的上清液；将烧杯放在磁力架上进行抗体的磁珠吸附，10min后取出磁珠，晾干后，用乙醇进行洗涤多次，然后，用0.1M甘氨酸，pH 3.0洗脱磁珠上的抗体，洗脱的次数是这样的：首先用50微升的0.15M NaCl,20mM Na2HPO4,pH7.0的缓冲液洗脱磁珠一次，洗脱液丢弃，然后，再用0.1M甘氨酸，pH 3.0洗脱磁珠，每次使用50微升进行洗脱，收集洗脱液为目标抗体溶液。

【技术特征摘要】
1.一种利用磁珠提取和纯化抗体的方法，该方法包括：准备杂交瘤细胞上清液于烧杯中；向上清液中加入磁珠，其中，上清液的体积与磁珠的比例为：20毫克磁珠对应100毫升的上清液；将烧杯放在磁力架上进行抗体的磁珠吸附，10min后取出磁珠，晾干后，用乙醇进行洗涤多次，然后，用0.1M甘氨酸，pH3.0洗脱磁珠上的抗体，洗脱的次数是这样的：首先用50微升的0.15MNaCl,20mMNa2HPO4,pH7.0的缓冲液洗脱磁珠一次，洗脱液丢弃，然后，再用0.1M甘氨酸，pH3...

【专利技术属性】
技术研发人员：付春辉，
申请(专利权)人：青岛汉德森生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37