抗体样蛋白质的纯化方法技术

本发明专利技术提供包含弱酸性条件下的洗脱工序的抗体样蛋白质的纯化方法。本发明专利技术提供一种抗体样蛋白质的纯化方法，其包含下述(a)～(b)的工序：(a)使抗体样蛋白质与含有固定化于载体的配体的亲和分离基质接触，从而使抗体样蛋白质吸附于亲和分离基质的工序；和(b)使pH3.5以上的洗脱液与亲和分离基质接触，将抗体样蛋白质洗脱的工序；前述配体含有在序列号1～5所述的来自蛋白A的E、D、A、B或C结构域的氨基酸序列中将Fc结合部位的Gln和/或Lys置换为Ala、Ser和/或Thr而得到的氨基酸序列，并且所述配体与前述置换前的配体相比，在酸性pH范围内的抗体结合能力降低。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】抗体样蛋白质的纯化方法
本专利技术涉及一种包含弱酸性条件下的洗脱工序的抗体样蛋白质的纯化方法。
技术介绍
进行抗体药物开发的核心是单克隆抗体，这些单克隆抗体正是使用重组培养细胞技术等大量地生产出来的。“单克隆抗体”是指由来自单一抗体产生细胞的克隆得到的抗体。由培养细胞生产出的单克隆抗体在利用各种色谱进行纯化后成为药品。色谱中，特别是利用固定化有蛋白A的亲和分离色谱进行的纯化能够一次性将抗体从动物细胞培养物纯化为高纯度，因此在抗体药品的制造中是必不可少的工序。蛋白A是由革兰氏阳性菌中的金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)所生产的细胞壁蛋白质的1种，由信号序列S、5个免疫球蛋白结合性结构域(E结构域、D结构域、A结构域、B结构域、C结构域)和作为细胞壁结合结构域的XM区构成(非专利文献1)。已经开发出多种通过蛋白质工程学方式对蛋白A加以改造、从而使其高功能化的技术。例如已知提高蛋白A的耐碱性、提高抗体酸解离特性、通过向固定化点导入变异而提高抗体结合容量等例子(专利文献1～4)。近年来，细胞培养中的抗体的生产效价在提高，对下游的纯化处理的负担也在增加。在使用固定化有蛋白A的亲和分离色谱的工序中，通常在中性pH下使抗体结合于载体后，在酸性pH下洗脱抗体，从而能够将抗体纯化。但是，已知有部分抗体会在低pH下发生聚集、或者抗体活性降低。这些现象不仅在抗体制造中成为纯化工序的负担(工序数增加、收率降低)，而且作为药品有时会带来严重的副作用。因此，需要能够在更高pH下洗脱的亲和分离色谱载体。已知为了提高抗体酸解离特性而进行33位的Ser的置换、18位的His的置换以及各种氨基酸残基置换为His等方案(专利文献3、5、6)。对应于蛋白A的Fc结合部位中的C结构域的第9位的Gln向Ala、Thr的置换变异虽然是已知的，但并未公开这些变异体的抗体酸解离特性(专利文献7、非专利文献2)。此外，对应于蛋白A的Fc结合部位中的C结构域的第35位的Lys的置换变异体已知有多种，但这些变异体的抗体酸解离特性并未公开(专利文献8)。现有技术文献专利文献专利文献1:国际公开第03/080655号专利文献2:欧洲专利第1123389号说明书专利文献3:国际公开第2011/118699号专利文献4:国际公开第2012/133349号专利文献5:国际公开第2012/087231号专利文献6:国际公开第2012/165544号专利文献7:国际公开第2015/005859号专利文献8:日本特开2007-252368号公报非专利文献非专利文献1:HoberS.等著、“J.Chromatogr.B”2007年、848卷、40-47页非专利文献2:O’SeaghdhaM.等著、“FEBSJ”、2006年、273卷、4831-4841页
技术实现思路
专利技术要解决的问题本专利技术的问题在于，提供包含弱酸性条件下的洗脱工序的抗体样蛋白质的纯化方法。用于解决问题的方案本专利技术人们对具有氨基酸置换变异的繁多的重组蛋白A变异体的活性进行了比较研究，结果发现，含有在序列号1～5所述的来自蛋白A的E、D、A、B或C结构域的氨基酸序列中将Fc结合部位的Gln和/或Lys置换为Ala、Ser和/或Thr而得到的氨基酸序列的配体，在酸性pH范围内的抗体结合能力与前述置换前的配体相比降低，从而完成了本专利技术。即，本专利技术涉及一种抗体样蛋白质的纯化方法，其包含下述(a)～(b)的工序：(a)使抗体样蛋白质与含有固定化于载体的配体的亲和分离基质接触，从而使抗体样蛋白质吸附于亲和分离基质的工序；和(b)使pH3.5以上的洗脱液与亲和分离基质接触，将抗体样蛋白质洗脱的工序；前述配体含有在序列号1～5所述的来自蛋白A的E、D、A、B或C结构域的氨基酸序列中将Fc结合部位的Gln和/或Lys置换为Ala、Ser和/或Thr而得到的氨基酸序列，所述配体与前述置换前的配体相比，在酸性pH范围内的抗体结合能力降低。]优选前述亲和分离基质为在水不溶性基材固定化有配体的载体。优选水不溶性基材含有合成高分子或多糖类。优选多糖类为纤维素或琼脂糖。优选洗脱液为含有选自由乙酸根离子、柠檬酸根离子、甘氨酸、琥珀酸根离子、磷酸根离子和甲酸根离子组成的组中的至少1种阴离子物种的酸性缓冲液。优选洗脱液中的来自宿主的蛋白质和/或免疫球蛋白的抗体样蛋白质的聚集体的含量减少。优选抗体样蛋白质的洗脱利用pH梯度洗脱进行。优选pH梯度洗脱利用pH4～6的洗脱液进行。纯化前的抗体样蛋白质可以为与源自宿主细胞的蛋白质的混合物。纯化前的抗体样蛋白质可以为与抗体样蛋白质的聚集体的混合物。专利技术的效果本专利技术的抗体样蛋白质的纯化方法能够在比以往高的pH下洗脱抗体样蛋白质。附图说明图1是葡萄球菌属(Staphylococcus)的蛋白A的E、D、A、B和C结构域的序列比较表。具体实施方式本专利技术为一种抗体样蛋白质的纯化方法，其包含下述(a)～(b)的工序：(a)使抗体样蛋白质与含有固定化于载体的配体的亲和分离基质接触，从而使抗体样蛋白质吸附于亲和分离基质工序；和(b)使pH3.5以上的洗脱液与亲和分离基质接触，将抗体样蛋白质洗脱的工序；前述配体含有在序列号1～5所述的来自蛋白A的E、D、A、B或C结构域的氨基酸序列中将Fc结合部位的Gln和/或Lys置换为Ala、Ser和/或Thr而得到的氨基酸序列，所述配体与前述置换前的配体相比，在酸性pH范围内的抗体结合能力降低。蛋白A是包含作为免疫球蛋白结合性结构域的E、D、A、B和C结构域的蛋白质。E、D、A、B和C结构域是能够结合于免疫球蛋白的互补决定区(CDR)以外的区域的免疫球蛋白结合性结构域，任一结构域均具有结合于免疫球蛋白的Fc区、Fab区和Fab区中的尤其是Fv区的活性。需要说明的是，本专利技术中对蛋白A的来源没有特别限定，优选来自葡萄球菌属(Staphylococcus)的蛋白A。“蛋白质”这一术语包括具有多肽结构的所有分子，片段化的或通过肽键而连接的多肽链也包括在“蛋白质”这一术语中。此外，“结构域”是蛋白质的高级结构中的单元，是指由数十到数百个氨基酸残基序列构成且足以表现出某种物理化学功能或生物化学功能的蛋白质的单元。来自结构域的氨基酸序列是指置换氨基酸前的氨基酸序列。来自结构域的氨基酸序列并非仅限于蛋白A的E、D、A、B或C结构域的野生型氨基酸序列，通过氨基酸的置换、插入、缺失和化学修饰而部分性改造过的氨基酸序列且具有与Fc区的结合能力蛋白质，则也包含在来自结构域的氨基酸序列中。作为来自结构域的氨基酸序列，可以列举例如：构成序列号1～5所述的葡萄球菌属的蛋白A的E、D、A、B和C结构域的氨基酸序列，此外可以列举：对于蛋白A的E、D、A、B和C结构域导入有将对应于C结构域的29位的Gly置换为Ala的变异的氨基酸序列所构成的蛋白质。此外在B结构域中导入有A1V和G29A这样的变异的Z结构域也具有与Fc区的结合能力，因此也属于来自结构域的氨基酸序列。来自结构域的氨基酸序列优选化学稳定性高的结构域或其变异体。来自结构域的氨基酸序列具有与Fc区的结合能力。来自结构域的氨基酸序列与序列号1～5所述的蛋白A的E、D、A、B或C结构域的序列同源性优选为85％以上，更优选为90％以本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗体样蛋白质的纯化方法，其包含下述(a)～(b)的工序：(a)使抗体样蛋白质与含有固定化于载体的配体的亲和分离基质接触，从而使抗体样蛋白质吸附于亲和分离基质的工序；和(b)使pH3.5以上的洗脱液与亲和分离基质接触，将抗体样蛋白质洗脱的工序；所述配体含有在序列号1～5所述的来自蛋白A的E、D、A、B或C结构域的氨基酸序列中将Fc结合部位的Gln和/或Lys置换为Ala、Ser和/或Thr而得到的氨基酸序列，并且所述配体与所述置换前的配体相比，在酸性pH范围内的抗体结合能力降低。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.07.22 JP 2015-1450071.一种抗体样蛋白质的纯化方法，其包含下述(a)～(b)的工序：(a)使抗体样蛋白质与含有固定化于载体的配体的亲和分离基质接触，从而使抗体样蛋白质吸附于亲和分离基质的工序；和(b)使pH3.5以上的洗脱液与亲和分离基质接触，将抗体样蛋白质洗脱的工序；所述配体含有在序列号1～5所述的来自蛋白A的E、D、A、B或C结构域的氨基酸序列中将Fc结合部位的Gln和/或Lys置换为Ala、Ser和/或Thr而得到的氨基酸序列，并且所述配体与所述置换前的配体相比，在酸性pH范围内的抗体结合能力降低。2.根据权利要求1所述的纯化方法，其中，所述亲和分离基质为在水不溶性基材固定化有配体的载体。3.根据权利要求1或2所述的纯化方法，其中，水不溶性基材含有合成高分子或多...

【专利技术属性】
技术研发人员：西八条正克，中野喜之，鸿池史宪，高野昌行，吉田慎一，水口和信，
申请(专利权)人：株式会社钟化，
类型：发明
国别省市：日本,JP