一种去除宿主细胞蛋白含量的亲和纯化工艺制造技术

本发明专利技术提供一种新的有效降低宿主细胞蛋白(HCP)含量的亲和纯化工艺，其具体步骤包括：步骤1、处理亲和填料，上样；步骤2、淋洗，使用pH值较低的缓冲液(3.9～5.6)，以及使用含有氯化钠、氯化钙和/或精氨酸盐酸作为添加剂的淋洗缓冲液2淋洗层析柱；步骤3、洗脱，使用不同pH洗脱缓冲液洗脱产品并收集产品。本发明专利技术所使用的材料去除HCP效果显著，适用范围广，可广泛适用于抗体类蛋白质亲和纯化工艺中，从而为有效控制抗体类药物中HCP的含量提供技术支持。

An affinity purification process for removing protein content of host cells

The present invention provides a new effective reduction of host cell protein (HCP) affinity purification technology content, includes the following steps: Step 1, affinity filler, sample; step 2, elution buffer using the low pH value (3.9 ~ 5.6), and the use of sodium chloride, calcium chloride and / or arginine hydrochloride as elution buffer additives 2 elution chromatography column; step 3, elution, elution and collection of products using different pH products elution buffer. The material used in the invention has significant effect on removing HCP, and has wide application range, which can be widely applied to the affinity purification process of antibody proteins, so as to provide technical support for effectively controlling the content of HCP in antibody drugs.

【技术实现步骤摘要】
一种去除宿主细胞蛋白含量的亲和纯化工艺
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种有效去除FC融合蛋白及单抗宿主细胞蛋白含量的亲和纯化工艺。
技术介绍
宿主细胞蛋白(HostCellProtein，HCP)是指来源于宿主细胞的蛋白质成分，是制备抗体类药物(包括抗体及FC融合蛋白)过程中需要去除的杂质。由于HCP的主要成分是蛋白质，即使很小的剂量，都有可能引发机体产生过敏反应。此外，部分HCP本身具有蛋白酶活性，残留在抗体类药物中，可能导致蛋白药物降解，最终影响药效。如果残留的HCP与抗体类药物之间存在相互作用，有可能阻断抗体类药物的活性位点，也会导致药效降低。因此，在抗体类药物制备过程中，必须严格控制HCP的含量，一般要求最终药物中HCP的含量<100ppm(pg/mg)。为了降低抗体类药物制剂中宿主蛋白质的残留量，目前主要是通过采用纯化工艺，并结合一定的检测定量手段(主要是通过酶联免疫检测HCP含量，通过UV280的吸收值来检测抗体及FC融合蛋白浓度)，来控制抗体类药物生产过程中残留的HCP的动态变化过程。目前在抗体类药物制备过程中，去除HCP的纯化工艺主要包括：亲和层析、阴离子交换层析和阳离子交换层析，以及集聚物沉淀和中间品深层过滤等。其中，亲和层析作为在抗体类药物制备过程中的关键工艺步骤，不仅能够对产品实行直接捕获，而且能够特异去除大部分的宿主细胞蛋白及其它杂质。随着上游细胞培养工艺的不断改进，CHO细胞目的蛋白的表达量得到显著提高，但与此同时HCP的表达量也被提高了。而且部分HCP能够与目的蛋白产生相互作用，或者与填料基质非特异吸附，从而导致在亲和纯化工艺中这些HCP非常难以去除，大量的HCP与目的蛋白一起被洗脱和收集，进而对后续纯化工艺造成非常大的困难，甚至可能导致最终产品HCP的含量无法满足质控标准。为了克服这一技术难题，最大限度的在捕获步骤降低HCP的含量，从而减轻后续纯化步骤的压力，本专利技术对亲和纯化工艺进行了系统优化，尤其在淋洗步骤改变淋洗的缓冲液的pH或者添加各种试剂，从而在不影响收率的前提下显著提高亲和纯化工艺对HCP的去除效率。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于，提供一种新的有效降低宿主细胞蛋白(HCP)含量的亲和纯化工艺，能够提高抗体类药物制备过程中亲和层析工艺去除HCP的效率，为FC融合蛋白及单抗类药物亲和纯化工艺提供更加可靠的选择。为解决上述技术问题，本专利技术提供的一种去除宿主细胞蛋白(HCP)含量的亲和纯化工艺，通过将改变淋洗步骤2的pH,通过加入氯化钠、氯化钙、精氨酸盐酸中的至少一种作为淋洗2过程中的添加剂，降低HCP同目的蛋白及填料基质间的相互作用，从而起到去除HCP的作用。其具体步骤包括：步骤1、处理亲和填料，上样；步骤2、淋洗，使用pH3.9～5.6的醋酸-醋酸钠缓冲液、Tris-盐酸缓冲液、柠檬酸缓冲液或磷酸缓冲液的淋洗缓冲液2淋洗柱层析；步骤3、洗脱，使用不同pH值的洗脱缓冲液洗脱产品并收集产品。具体的，所述步骤1具体操作方法是：1a、亲和填料装柱，用2-5倍柱体积的平衡缓冲液漂洗层析柱；1b、然后用3-5倍柱体积的NaOH溶液消毒层析柱；1c、用3-5倍柱体积的平衡缓冲液平衡层析柱；1d、上样，让样品在柱上保留2-10分钟。具体的，所述亲和填料配基为ProteinA。所述亲和填料包括但不限于GEhealthcare的MabSelectSuRe和MabSelectSuReLX，Merck的EshmunoA，JSR的A3。具体的，所述步骤2的具体操作方法是：2a、用3-5倍平衡缓冲液淋洗层析柱；2b、用3-5倍柱体积的淋洗2缓冲液淋洗层析柱。2c、用3-5倍柱体积的淋洗3缓冲液淋洗层析柱。具体的，所述步骤3的具体操作方法是：用3-10倍不同pH的洗脱缓冲液洗脱产品。具体的，所述亲和纯化工艺还包括步骤4：对层析柱进行再生处理。步骤4中，优选采用2-5倍柱体积的1M醋酸对层析柱进行再生处理。具体的，所述亲和纯化工艺还包括步骤5：对层析柱进行平衡和保存。步骤5的具体操作方法是：5a、用2-5倍柱体积的平衡缓冲液漂洗层析柱；5b、用3-5倍柱体积的NaOH溶液消毒层析柱；5c、用2-5倍柱体积的平衡缓冲液漂洗层析柱；5d、用2-5倍柱体积的保存液保存层析柱。优选的，所述1a、1c、2a、5a、5c步骤中所用的平衡缓冲液为磷酸盐缓冲液或Tris-醋酸缓冲液，其pH为7.2-7.6，盐浓度为0.15M的。优选的，所述1b、5b步骤中所用的NaOH溶液的浓度为0.1M。优选的，所述淋洗2缓冲液为Tris-盐酸缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液、柠檬酸缓冲液或磷酸缓冲液，其pH为3.9～5.6、浓度为20-50mM。所述淋洗2缓冲液还可以含有氯化钠、氯化钙和/或精氨酸盐酸作为添加剂，其中，氯化钠的浓度为0-2M，氯化钙的浓度为0-0.5M，精氨酸盐酸的浓度为0-0.5M。所述淋洗2缓冲液的pH优选为4.0～4.5。优选的，所述淋洗3缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲液或柠檬酸缓冲液，其浓度为20-50mM，pH为5.2～5.7。优选的，所述保存液为20％乙醇。本专利技术的亲和纯化工艺所使用的材料去除HCP效果显著，适用范围广，可广泛适用于抗体类蛋白质亲和纯化工艺中，从而为有效控制抗体类药物中HCP的含量提供技术支持。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术。本专利技术采用的试剂皆为普通市售品，皆可市场购得。附图说明图1为实施例1中pH4.2、4.3、4.4的淋洗2缓冲液淋洗亲和层析图谱。图2为图1的局部放大图。图3为实施例1中pH4.0、4.5、5.5、9.0的淋洗2缓冲液淋洗亲和层析图谱。图4为图3的局部放大图。图5为实施例2中Fc融合蛋白在淋洗2中加入盐离子及精氨酸的亲和层析图谱。图6为图5的局部放大图。具体实施方式下面将结合附图对本专利技术的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本专利技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。为了对本专利技术所公开的新的亲和纯化工艺进行进一步阐述，现结合抗体类药物制备过程中实施的亲和层析案例进行详细说明。亲和层析在GE的AKTApureM仪器上完成，涉及的各项检测包括有：1)蛋白质浓度：通过UV280的吸收值来检测；2)单体纯度：通过分子排阻高效液相色谱法(SEC-HPLC)检测；3)HCP含量：通过酶联免疫检测。本专利技术所用的亲和介质是ProteinA配基交联到包括但不限于琼脂糖、羟基化聚醚树脂、聚丙烯酸树脂、聚苯乙烯二乙烯苯基树脂、聚甲基丙烯酸树脂、聚苯乙烯树脂、羟基磷灰石、玻璃等基质上的层析介质，优选基质为琼脂糖。优选的亲和填料有GEhealthcare的MabSelectSuRe和MabSelectSuReLX，Merck的EshmunoA，JSR的A3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种去除宿主细胞蛋白含量的亲和纯化工艺，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、处理亲和填料，上样；步骤2、淋洗，使用淋洗2缓冲液淋洗柱层析；所述淋洗2缓冲液为pH 3.9～5.6的醋酸‑醋酸钠缓冲液、Tris‑盐酸缓冲液、柠檬酸缓冲液或磷酸缓冲液；步骤3、洗脱，收集产品。

【技术特征摘要】
1.一种去除宿主细胞蛋白含量的亲和纯化工艺，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、处理亲和填料，上样；步骤2、淋洗，使用淋洗2缓冲液淋洗柱层析；所述淋洗2缓冲液为pH3.9～5.6的醋酸-醋酸钠缓冲液、Tris-盐酸缓冲液、柠檬酸缓冲液或磷酸缓冲液；步骤3、洗脱，收集产品。2.如权利要求1所述的亲和纯化工艺，其特征在于，所述步骤1具体操作方法是：1a、亲和填料装柱，用2-5倍柱体积的平衡缓冲液漂洗层析柱；1b、然后用3-5倍柱体积的NaOH溶液消毒层析柱；1c、用3-5倍柱体积的平衡缓冲液平衡层析柱；1d、上样，让样品在柱上保留2-10分钟。3.如权利要求1或2所述的亲和纯化工艺，其特征在于，所述亲和填料配基为ProteinA；所述亲和填料包括GEhealthcare的MabSelectSuRe和MabSelectSuReLX，Merck的EshmunoA，JSR的A3。4.如权利要求1所述的亲和纯化工艺，其特征在于，所述步骤2的具体操作方法是：2a、用3-5倍平衡缓冲液淋洗层析柱；2b、用3-5倍柱体积的淋洗2缓冲液淋洗层析柱；2c、用3-5倍柱体积的淋洗3缓冲液淋洗层析柱。5.如权利要求1所述的亲和纯化工艺，其特征在于，所述步骤3的具体操作方法是：用3-10倍洗脱缓冲液洗脱产品。6.如权利要求1所述的亲和纯化工艺，其特征在于，所述亲和纯化工艺还包括步骤4：对层析柱进行再生处理。7.如权利要求6所述的亲和纯化工艺，其特征在于，所述步骤4中的具体操作方法是：采用2-5倍柱体积的1M醋酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘海宽，林森珠，韩金玉，吴桃利，沈克强，周伟昌，陈智胜，
申请(专利权)人：上海药明生物技术有限公司，无锡药明康德生物技术股份有限公司，苏州药明康德检测检验有限责任公司，
类型：发明
国别省市：上海,31