一种高效富集水牛细胞蛋白质的方法技术

本发明专利技术涉及蛋白质提取技术领域，特别涉及一种高效富集水牛细胞蛋白质的方法，该方法包括细胞裂解、蛋白质样品制备、蛋白质纯化和肽段回收等步骤，采用非接触式超声破碎样品结合磁珠进行蛋白质富集的方法，大大减少了样品使用量并提高了蛋白质的提取效率，该技术操作实用性强，且易普及，为蛋白质组学技术用于微量或珍贵样品的研究提供了行之有效的样品处理方法，使之能够满足蛋白质组学研究所需的样品条件该发明专利技术的样本处理方法解决了目前微量样品无法满足蛋白质组学研究所需样本量的瓶颈问题，也为单细胞蛋白质组学分析提供了可行性方案，是一种高效富集水牛细胞蛋白质的方法。

A highly efficient method for enriching the protein of buffalo cells

The invention relates to the field of protein extraction, in particular a method for high efficient enrichment of protein in Buffalo cells. This method includes the steps of cell cracking, protein preparation, protein purification and peptide recovery and so on. The method of protein enrichment is greatly reduced by using non-contact ultrasonic broken samples and magnetic beads into protein enrichment. The use of the sample and the extraction efficiency of protein is improved. The technique is very practical and easy to be popularized. It provides an effective method for sample processing for the study of micro or precious samples by proteomics technology, so that it can meet the sample conditions needed for the study of proteomics and the sample processing method of the invention. It also solves the bottleneck problem that the micro sample can not meet the sample size of the proteomics research. It also provides a feasible solution for the single cell proteomics analysis. It is a highly efficient method for enriching the protein of buffalo cells.

【技术实现步骤摘要】
一种高效富集水牛细胞蛋白质的方法
本专利技术涉及蛋白质提取
，特别涉及一种高效富集水牛细胞蛋白质的方法。
技术介绍
中国水牛均为沼泽型，原为南部地区的役畜，后来随着农业机械化，水牛乳肉价值逐渐取代了其役用价值，但是中国水牛繁殖效率低，又使其乳肉价值得不到很好的开发，而生殖细胞成熟质量是影响水牛繁殖率的主要原因之一，这种复杂性主要表现在转录、翻译和翻译后修饰及调控网络上。蛋白质是生命功能的执行者，采用高通量的蛋白质组学技术可大规模发现蛋白质的表达和翻译后修饰，有助于从整体上揭示生殖细胞发育的蛋白质调控网络，筛选和鉴定关键基因或生物标志物，所以有必要对水牛的卵母细胞及早期胚胎的蛋白质组进行研究，以期为提高水牛繁殖能力奠定基础。2014年，DanielaR.Deutsch等人利用1600个卵母细胞或者早期胚胎共鉴定到1072种蛋白质；2015年，陈富美等人利用1000个GV期和MII期的水牛卵母细胞鉴定到574种蛋白质；2016年，陈凌声等人从522个GV期和545个MII期水牛卵母细胞中分别鉴定到647和570种蛋白质，水牛卵母细胞及早期胚胎材料极为珍贵，传统的蛋白质组学方法对细胞样品上样量要求需要上千个细胞，而常规的蛋白质分离纯化方法不能高效富集水牛卵母细胞及早期胚胎的微量蛋白质，给水牛的繁殖研究带来了一定的困难，所以迫切需要找出一种可高效富集水牛卵母细胞及早期胚胎微量蛋白质的方法，能有效的提高蛋白质提取效率，满足分析所需上样量的需求，从而实现水牛微量生物样品甚至单个细胞蛋白的蛋白质组学研究。
技术实现思路
鉴于上述内容，有必要提供一种可高效富集水牛卵母细胞及早期胚胎微量蛋白质的方法，能有效的提高蛋白质提取效率，满足分析所需上样量的需求，从而实现水牛微量生物样品甚至单个细胞蛋白的蛋白质组学研究。为达到上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种高效富集水牛细胞蛋白质的方法，所述方法为：先将磁珠进行预处理得到均质磁珠溶液，然后富集水牛细胞并将其放在冰上进行第一次裂解；向第一次裂解后的水牛细胞加入均质磁珠溶液和三氟代乙醇的混合物并进行第二次裂解；然后对第二次裂解液进行蛋白质纯化、肽段回收得到富集后的水牛细胞蛋白质；进一步的，所述水牛细胞为水牛卵母细胞或水牛早期胚胎细胞；所述水牛早期胚胎细胞包括孤雌激活胚胎细胞和体外受精胚胎细胞：所述水牛卵母细胞的富集方法包括以下步骤：(1)预处理卵巢：剪去水牛卵巢多余组织，用39℃的双抗生理盐水清洗2-3遍，清洗完后将卵巢置于39℃左右的双抗生理盐水中，并在39℃的恒温水浴条件下保温完成水牛卵巢预处理；(2)用含有1-2mL洗卵液的10mL注射器抽取步骤(1)预处理后卵巢表面的卵泡，将抽取的卵泡液连同洗卵液一起放入60mm的捡卵皿中，在体式显微镜下挑选卵丘卵母细胞复合体，剔除裸卵和蜘蛛网状卵；(3)将步骤(2)挑选的卵丘卵母细胞复合体依次用洗卵液和成熟液各清洗2-3遍，然后置于成熟液中并放在39℃含有体积百分数为5％二氧化碳的培养箱中培养22-24h后，用200μL的移液器吹打成熟后的卵母细胞至周围无颗粒细胞，然后向卵母细胞中加入链酶蛋白酶去除透明带，用DPBS缓冲液清洗2-3遍后装于PCR管中并置于-80℃保存，完成水牛卵母细胞的富集；所述孤雌激活胚胎细胞的制备方法为：将裸露的MII期卵母细胞在5mol/L的离子霉素中处理5min，然后用2mmol/L的6-DMHP溶液处理4-6h，将处理好的卵母细胞在培养液中清洗2-3遍，移入培养液中进行培养，收集分裂至2-细胞期的早期胚胎，然后向2-细胞用中加入链酶蛋白酶去除透明带，用DPBS缓冲液清洗2-3遍后装于PCR管中并置于-80℃保存，得到孤雌激活胚胎细胞；所述培养的培养时间为24h；所述体外受精胚胎细胞的制备方法为：将裸露的MII期卵母细胞在受精液中洗2-3遍，移入受精液中进行受精，所述培养的滴液每滴含有15-20个MII期卵母细胞，每滴加入处理后的精液15μl，在培养箱中受精6-8h，吹掉死精子，将受精后的卵母细胞移入单层颗粒细胞中共同培养12h后，收集分裂至2-细胞的早期胚胎，然后向2-细胞用中加入链酶蛋白酶去除透明带，用DPBS缓冲液清洗2-3遍后装于PCR管中并置于-80℃保存，得到体外受精胚胎细胞。进一步的，所述洗卵液含有如下成分：质量百分数为0.99％的TCM199溶液、NaHCO3溶液5mmol/L、Hepes缓冲液20mmol/L、肝素钠0.004μg/ml、新生牛血清3％、青霉素600mg/L、链霉素100mg/L，余量为水，PH为7.2-7.4；所述成熟液含有如下成分：质量百分数为0.99％的TCM199溶液、NaHCO3溶液5mmol/L、Hepes缓冲液20mmol/L、质量百分数为10％的胎牛血清、乳酸钠0.026％、卵泡刺激素0.5μg/ml、促黄体生成素5μg/ml，余量为水，PH为7.2-7.4；所述受精液含有如下成分：质量百分数为1.2916％的Tyrode’s液(台氏液)、肝素钠溶液20μg/ml、2.0mmol/L咖啡因、牛血清白蛋白6.0mg/ml，余量为水，pH7.5-7.8；所述培养液含有如下成分：体积百分数为54％的所述受精液、体积百分数为36％的所述成熟液、体积百分数为10％的胎牛血清，pH7.2-7.4。进一步的，所述磁珠进行预处理的方法包括如下步骤：①将保存在4℃下的亲水性磁珠A和疏水性磁珠B取出分别放置在室温下摇匀；②分别取20μl步骤①的亲水性磁珠A、疏水性磁珠B和160μl超纯水混合，并置于PCR管内混匀；③将步骤②含有磁珠的PCR管置于磁力架上静置，待磁珠吸附至管底后去掉上清；④将步骤③的PCR管从磁力架上取下，加入超纯水200μl混匀，重新放置磁力架上静置，待磁珠吸附至管底后去掉上清，此步骤重复3次；⑤向步骤④的PCR管中加入超纯水100μl混匀，4℃长期保存。进一步的，所述第一次裂解的方法为：取富集的水牛细胞1-25个，向水牛细胞中加入20μl的裂解液并放置在温度为-2℃～0℃的冰上裂解10min。进一步的，所述第二次裂解的方法包括如下步骤：A、将第一次裂解后的溶液：预处理磁珠：三氟代乙醇按照体积比为5:1:5进行混合；B、将步骤A的混合物放入冰浴中进行超声处理，所述超声处理的处理方式为间隔超声处理，按照“超声5s-间隔30s-超声5s”的处理方式进行循环，超声处理的总时长为15min；超声处理后进行2s的离心处理得到第二次裂解液；C、向步骤B离心处理后的第二次裂解液中加入质量百分数为0.1％的甲酸0.75μl,混匀；D、将步骤C的混合液放入PCR仪中反应，反应条件为：95℃6min，0℃50s，45℃30min；E、向步骤D反应液中加入400mmol的吲哚-3-乙酸5μl，在室温下孵育30min；F、步骤E孵育结束后，向反应液中加入200mmol的二硫苏糖醇5μl，终止反应。进一步的，所述蛋白质纯化的方法包括如下步骤：步骤1：取第二次裂解后得到的混合液54.75μl与质量百分数为1％的甲酸溶液10μl均匀混合；步骤2：向步骤1的混合液中加入乙腈溶液，使乙腈最终的质量浓度达到50％；步骤3：将步骤2的混合液在室温下静置8min，然后再放置在本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高效富集水牛细胞蛋白质的方法，其特征在于，所述方法为：先将磁珠进行预处理得到均质磁珠溶液，然后富集水牛细胞并将其放在冰上进行第一次裂解；向第一次裂解后的水牛细胞加入均质磁珠溶液和三氟代乙醇的混合物并进行第二次裂解；然后对第二次裂解液进行蛋白质纯化、肽段回收得到富集后的水牛细胞蛋白质。

【技术特征摘要】
1.一种高效富集水牛细胞蛋白质的方法，其特征在于，所述方法为：先将磁珠进行预处理得到均质磁珠溶液，然后富集水牛细胞并将其放在冰上进行第一次裂解；向第一次裂解后的水牛细胞加入均质磁珠溶液和三氟代乙醇的混合物并进行第二次裂解；然后对第二次裂解液进行蛋白质纯化、肽段回收得到富集后的水牛细胞蛋白质。2.根据权利要求1所述的一种高效富集水牛细胞蛋白质的方法，其特征在于，所述水牛细胞为水牛卵母细胞或水牛早期胚胎细胞；所述水牛早期胚胎细胞包括孤雌激活胚胎细胞和体外受精胚胎细胞：所述水牛卵母细胞的富集方法包括以下步骤：(1)预处理卵巢：剪去水牛卵巢多余组织，用39℃的双抗生理盐水清洗2-3遍，清洗完后将卵巢置于39℃左右的双抗生理盐水中，并在39℃的恒温水浴条件下保温完成水牛卵巢预处理；(2)用含有1-2mL洗卵液的10mL注射器抽取步骤(1)预处理后卵巢表面的卵泡，将抽取的卵泡液连同洗卵液一起放入60mm的捡卵皿中，在体式显微镜下挑选卵丘卵母细胞复合体，剔除裸卵和蜘蛛网状卵；(3)将步骤(2)挑选的卵丘卵母细胞复合体依次用洗卵液和成熟液各清洗2-3遍，然后置于成熟液中并放在39℃含有体积百分数为5％二氧化碳的培养箱中培养22-24h后，用200μL的移液器吹打成熟后的卵母细胞至周围无颗粒细胞，然后向卵母细胞中加入链酶蛋白酶去除透明带，用DPBS缓冲液清洗2-3遍后装于PCR管中并置于-80℃保存，完成水牛卵母细胞的富集；所述孤雌激活胚胎细胞的制备方法为：将裸露的MII期卵母细胞在5mol/L的离子霉素中处理5min，然后用2mmol/L的6-DMHP溶液处理4-6h，将处理好的卵母细胞在培养液中清洗2-3遍，移入培养液滴中进行培养，收集分裂至2-细胞期的早期胚胎，然后向2-细胞用中加入链酶蛋白酶去除透明带，用DPBS缓冲液清洗2-3遍后装于PCR管中并置于-80℃保存，得到孤雌激活胚胎细胞；所述培养的培养时间为24h；所述体外受精胚胎细胞的制备方法为：将裸露的MII期卵母细胞在受精液中洗2-3遍，移入受精液中进行受精，所述培养的滴液每滴含有15-20个MII期卵母细胞，每滴加入处理后的精液15μl，在培养箱中受精6-8h，吹掉死精子，将受精后的卵母细胞移入单层颗粒细胞中共同培养12h后，收集分裂至2-细胞的早期胚胎，然后向2-细胞用中加入链酶蛋白酶去除透明带，用DPBS缓冲液清洗2-3遍后装于PCR管中并置于-80℃保存，得到体外受精胚胎细胞。3.根据权利要求2所述的一种高效富集水牛细胞蛋白质的方法，其特征在于，所述洗卵液含有如下成分：质量百分数为0.99％的TCM199溶液、NaHCO3溶液5mmol/L、Hepes缓冲液20mmol/L、肝素钠0.004μg/ml、新生牛血清3％、青霉素600mg/L、链霉素100mg/L，余量为水，PH为7.2-7.4；所述成熟液含有如下成分：质量百分数为0.99％的TCM199溶液、NaHCO3溶液5mmol/L、Hepes缓冲液20mmol/L、质量百分数为10％的胎牛血清、乳酸钠0.026％、卵泡刺激素0.5μg/ml、促黄体生成素5μg/ml，余量为水，PH为7.2-7.4；所述受精液含有如下成分：质量百分数为1.2916％的Tyrode’s液、肝素钠溶液20μg/ml、2.0mmol/L咖啡因、牛血清白蛋白6.0mg/ml，余量为水，pH7.5-7.8；所述培养液含有如下成分：体积百分数为54％的所述受精液、体积百分数为36％的所述成熟液、体积百分数为10％的胎牛血清，pH7.2-7.4。4.根据权利要求1所述的一种高效富集水牛细胞蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：张明，濮黎萍，陈富美，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：广西,45