一种检测替格瑞洛药效的试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及一种检测替格瑞洛药效的试剂盒及检测方法。该试剂盒含有两条引物、总DNA、2×KAPA HiFi HotStart ReadyMix和去离子水，所述引物为5’‑ACTCCTACGGGRSGCAGCAG‑3’和5’‑GGACTACVVGGGTATCTAATC‑3’。该试剂盒能够检测患者服用替格瑞洛后的药物疗效，为临床指导药物调整及个体化抗血小板治疗提供了新的依据。

A kit for detecting the efficacy of the drug and its detection method

The invention relates to the field of biotechnology, in particular to a kit and a detection method for detecting the efficacy of tiglilol. The kit contains two primers, total DNA, 2 *KAPA HiFi HotStart ReadyMix and deionized water. The primers are 5'ACTCCTACGGGGRSGCAGCAG 3'and 5 GGACTACVGGGGTATCTAATC The kit can be used to detect the efficacy of tigrilol and provide a new basis for clinical guidance of drug adjustment and individualized antiplatelet therapy.

【技术实现步骤摘要】
一种检测替格瑞洛药效的试剂盒及检测方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种检测替格瑞洛药效的试剂盒及检测方法。
技术介绍
急性ST段抬高型心肌梗死(ST-segmentelevationmyocardialinfarction,STEMI)为累及心肌全层的透壁性心肌梗死，在急性期的死亡率极高，危害性很大。STEMI的发病机制是在冠状动脉粥样硬化的基础上斑块破裂，斑块下脂质、胶原暴露，使血小板激活、附着、聚集，并最终激活血小板糖蛋白受体，使血小板聚集并结合纤维蛋白而致血栓形成，导致急性血管闭塞，进而导致闭塞血管供血区域心肌坏死。由于血小板聚集和激活在冠状动脉粥样硬化斑块形成及斑块破裂形成血栓过程中具有重要作用，因此目前冠心病治疗的重要策略仍然是防止血栓事件的发生。目前临床上常用的抗血小板药物主要包括阿司匹林(抑制血小板花生四烯酸代谢)、氯吡格雷(抑制二磷酸腺苷ADPP2Y12受体活性)、替罗非班(抑制血小板膜GPⅡb/Ⅲa受体活性)和西洛他唑(抑制磷酸二脂酶活性)等。这些药物大多数为不可逆性抑制并且为单靶点作用的药物，虽然能抑制血小板活化过程中的某个作用靶点，但由于其作用机制单一，服用后仍能通过其它靶点通路引起血小板的活化，使其治疗效果被减弱。研究表明，4-30％人群对氯吡格雷的反应性低下或无反应，这部分患者发生心血管事件的风险明显增加，严重影响患者的治疗效果和临床预后，这种现象被称为氯吡格雷抵抗，氯吡格雷抵抗患者在优化抗血小板治疗后，仍然存在一定程度的血小板聚集和活化，即治疗后血小板高反应。2011年7月获美国FDA批准上市的替格瑞洛是第一个口服可逆P2Y12受体抑制剂。2012年11月29日，替格瑞洛(商品名为倍林达)通过我国国家食品药品监督管理局(SFDA)审批，正式进入我国市场。替格瑞洛是一种环戊基三唑嘧啶类药物，能够选择性地拮抗二磷酸腺苷受体，可逆性地作用于血小板细胞上的嘌呤2受体亚型P2Y12，且不引起后者构象的改变，是目前治疗急性冠状动脉综合征的新型药物。ONSET/OFFSET研究显示其在口服后比氯吡格雷起效更加快速，血小板抑制程度更高，同时又因其是可逆性抑制P2Y12受体，因此在停药后比氯吡格雷更快使血小板功能恢复至正常水平。由于替格瑞洛无需肝脏代谢，可直接转化为活性物质，因此能够很好的适用于氯吡格雷抵抗的患者。替格瑞洛较氯吡格雷有更好的血小板抑制作用及降低心血管病风险的作用，在急性冠状动脉血栓性疾病中应用范围更广。然而在血小板抑制剂药物的研究中发现，部分患者在服用替格瑞洛早期的一段时间后仍然存在一定程度的血小板聚集，降低了临床常规抗血小板治疗效果及增加了血栓事件的发生。由于替格瑞洛对STEMI的作用及活性存在这种早期疗效方面的个体差异，因此寻找一种新的方法检测替格瑞洛对STEMI患者的治疗效果，为检测替格瑞洛药效提供新的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对目前临床上急性ST段抬高型心肌梗死患者服用替格瑞洛后的用药效果存在个体差异，一部分患者服用替格瑞洛后不能获得很好的抗血小板治疗效果并从中收益，从而提出一种检测替格瑞洛药效的试剂盒及检测方法。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：一种检测替格瑞洛药效的试剂盒，该试剂盒含有两条引物、总DNA、2×KAPAHiFiHotStartReadyMix和去离子水，所述引物为5’-ACTCCTACGGGRSGCAGCAG-3’和5’-GGACTACVVGGGTATCTAATC-3’。所述引物是根据肠道菌属16SrDNA所设计，所述肠道菌属为葡萄球菌属和不动杆菌属。一种检测替格瑞洛药效的检测方法，该检测方法包括如下步骤步骤1：将研究对象进行分组；步骤2：从研究对象粪便中提取肠道菌群DNA样本并进行总DNA质检；步骤3：利用权利要求1所述的试剂盒对总DNA进行PCR扩增和产物定量；步骤4：根据葡萄球菌属和不动杆菌属在研究对象相对丰度差异，确定研究对象服用替格瑞洛的药效。该检测方法步骤1中DNA质检方法，是利用紫外微量分光光度计和1％琼脂糖凝胶电泳进行。该检测方法步骤3是以稀释5倍后的总DNA为模板，使用高保真酶进行PCR。一种检测替格瑞洛药动学的方法，该方法检测替格瑞洛及主要代谢产物AR-C124910XX的血药浓度，通过高效液相色谱串联质谱法进行检测，包括如下步骤：步骤1：从研究对象采取静脉血浆并-80℃保存备用；步骤2：设定色谱条件和质谱条件；步骤3：对血浆样本处理。所述药动学为急性ST段抬高型心肌梗死患者服用替格瑞洛后血浆中各时间点的替格瑞洛及其主要代谢产物AR-C124910XX的血药浓度，所述药效学为急性ST段抬高型心肌梗死患者服用替格瑞洛后各时间点的ADP诱导的血小板聚集率。所述串联质谱高效液相色谱法用0.1％甲酸水:乙腈＝3:7等度洗脱，流速为0.2mL/min；进样量为10μL。应用电喷雾电离源，多反应检测离子检测方式，离子源喷射电压为4500eV,源温度为450℃。本专利技术包括以下有益效果：本专利技术提供了一种应用葡萄球菌属和不动杆菌属检测替格瑞洛的药动学和药效学的方法，通过肠道葡萄球菌属和不动杆菌属在STEMI患者肠道中的相对丰度多少，能够检测患者服用替格瑞洛后的药物疗效，为临床指导药物调整及个体化抗血小板治疗提供了新的依据。附图说明图1：两组在门水平和属水平的物种相对丰度柱状图。(一)为两组在门水平的物种相对丰度柱状图；(二)为两组在属水平的物种相对丰度柱状图；A为正常反应组；B为高反应组。图2：。正常反应组和高反应组Alpha多样性分图。(一)为chao1指数多样性图；(二)为observed_species多样性指数图。图3：正常反应组和高反应组服药前及服药后各时间点血小板聚集率检测。图4：正常反应组和高反应组服药前后各时间点替格瑞洛血药浓度(ng/mL)。图5：正常反应组和高反应组服药前后各时间点AR-C124910XX血药浓度(ng/mL)。具体实施方式下面将结合附图和实施例对本专利技术的实施方案进行详细说明，以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本专利技术，下列附图和实施例仅用于说明本专利技术，但不以任何形式限制本专利技术。本文中所使用的各种实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。实施例1申请人收录了155例STEMI患者，患者服用负荷剂量180mg替格瑞洛后2h后，根据光比浊法检测血小板聚集率(Plateletaggregationrate，PA)，将PA≤59％患者分为血小板正常反应组(90例)，将PA＞59％患者分为血小板高反应组(65例)，通过检测两组患者服药后4h、6h、8h、12h和24h各时间点的血小板聚集率以及血浆中替格瑞洛和其主要代谢产物AR-C124910XX的血药浓度以阐明STEMI患者服用替格瑞洛后的用药效果。并且通过检测两组患者的粪便样本中肠道菌群的16SrDNA测序及显著性差异分析研究，描述两组粪便微生物群落的差异，找出两组粪便样本中的差异菌属。1、临床血液标本及粪便标本收集155例于沈阳军区总医院心内科胸痛中心就诊并接受急诊冠脉介入治疗的STEMI患者，对录入患者进行用药前评估肝肾功能，血糖血脂指标，基本情况如年龄、体重、吸烟、糖尿病、高血压、心肌梗死病史。录入患者病情诊断明确本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测替格瑞洛药效的试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有两条引物、总DNA、2×KAPA HiFi HotStart ReadyMix和去离子水，所述引物为5’‑ACTCCTACGGGRSGCAGCAG‑3’和5’‑GGACTACVVGGGTATCTAATC‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种检测替格瑞洛药效的试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有两条引物、总DNA、2×KAPAHiFiHotStartReadyMix和去离子水，所述引物为5’-ACTCCTACGGGRSGCAGCAG-3’和5’-GGACTACVVGGGTATCTAATC-3’。2.根据权利要求1所述的一种检测替格瑞洛药效的检测方法，其特征在于，所述引物是根据肠道菌属16SrDNA所设计，所述肠道菌属为葡萄球菌属和不动杆菌属。3.一种检测替格瑞洛药效的检测方法，其特征在于，该检测方法包括如下步骤步骤1：将研究对象进行分组；步骤2：从研究对象粪便中提取肠道菌群DNA样本并进行总DNA质检；步骤3：利用权利要求1所述的试剂盒对总DNA进行PCR扩增和产物定量；步骤4：根据葡萄球菌属和不动杆菌属在研究对象相对丰度差异，确定研究对象服用替格瑞洛的药效。4.根据权利要求3所述的一种检测替格瑞洛药效的检测方法，其特征在于，该检测方法步骤1中DNA质检方法，是利用紫外微量分光光度计和1%琼脂糖凝胶电泳进行。5.根据权利要求3所述的一种检测替格瑞洛药效的检测方法，其特征在于，该检测方法步骤3是以稀释5倍后的总DNA为模板，使用高保真酶进行PCR。6.一种检测替格瑞洛药动学的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩雅玲，童方念，张效林，曹禹，李毅，田孝祥，闫承慧，刘丹，
申请(专利权)人：中国人民解放军沈阳军区总医院，
类型：发明
国别省市：辽宁,21