一种能同时表达CD19 CAR和敲低T细胞表面PD-1表达的质粒结构及其构建方法技术

本发明专利技术涉及一种能同时表达CD19CAR和敲低T细胞表面PD‑1表达的质粒结构，包括依次串联的H1启动子、由H1启动子启动的抗PD‑1shRNA序列、EF1α启动子以及由EF1α启动子启动的三代CD19CAR序列；所述三代CD19CAR序列由CD19单链可变区、人CD8α铰链区、人CD28跨膜区和胞内区、人41BB胞内区、以及人CD3ζ胞内区串联构成。本发明专利技术所提供的质粒结构，将其用慢病毒转导进T细胞，比采用CRISPR/Cas9敲除PD‑1在生产CART细胞的工艺上简化了很大一步；并且这些CART细胞在体外受到抗原刺激后表现出了杀肿瘤细胞毒性的增强，细胞持久性的修复以及细胞因子分泌能力的上升。

Plasmid structure capable of expressing CD19 CAR at the same time and knocking down PD-1 expression on T cell surface and its construction method

The present invention relates to a plasmid structure capable of simultaneously expressing CD19CAR and knocking down PD_1 expression on the surface of T cells, including sequentially connected H1 promoter, anti-PD_1shRNA sequence initiated by H1 promoter, EF1a promoter and three-generation CD19CAR sequence initiated by EF1a promoter. The three-generation CD19CAR sequence consists of CD19 single-chain variable region and human CD19 variable region. The 8 alpha hinge region, human CD28 transmembrane region and intracellular region, human 41BB intracellular region and human CD3_intracellular region are composed in series. The plasmid structure provided by the present invention, which is transfected into T cells by lentiviruses, is a great step simpler than that by CRISPR/Cas9 knockout of PD_1 in the production of CART cells, and these CART cells exhibit enhanced cytotoxicity, durable repair of cells and cytokines after being stimulated by antigens in vitro. Secretory capacity increased.

【技术实现步骤摘要】
一种能同时表达CD19CAR和敲低T细胞表面PD-1表达的质粒结构及其构建方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种能同时表达CD19CAR和敲低T细胞表面PD-1表达的质粒结构及其构建方法。技术背景美国食品和药物管理局(FDA)在2017年8月30日批准了第一个基因治疗，他们批准了Kymriah(tisagenlecleucel)治疗一些患有急性淋巴细胞白血病(ALL)的儿童和年轻成人患者。Kymriah是一种基因改良的自体T细胞免疫疗法，即嵌合抗原受体T细胞(CART)免疫疗法。最常见的CARs包括了一段抗原识别序列，比如一段单克隆抗体(mAb)的单链可变区片段(scFv)，以及主要来自于激活T细胞胞内信号域的TCRζ链(LeeDW,BarrettDM,MackallC,OrentasR,GruppSA.TheFutureIsNow:ChimericAntigenReceptorsasNewTargetedTherapiesforChildhoodCancer.ClinCancerRes.2012；18(10):2780-2790.doi:10.1158/1078-043本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种能同时表达CD19CAR和敲低T细胞表面PD‑1表达的质粒结构pLVX‑H1‑shRNA‑EF1α‑CD19，其特征在于，包括：依次串联的H1启动子、由H1启动子启动的抗PD‑1 shRNA序列、EF1α启动子以及由EF1α启动子启动的三代CD19 CAR序列；所述三代CD19 CAR序列由CD19单链可变区、CD8α铰链区、CD28跨膜区和胞内区、41BB胞内区、以及CD3ζ胞内区串联构成。

【技术特征摘要】
1.一种能同时表达CD19CAR和敲低T细胞表面PD-1表达的质粒结构pLVX-H1-shRNA-EF1α-CD19，其特征在于，包括：依次串联的H1启动子、由H1启动子启动的抗PD-1shRNA序列、EF1α启动子以及由EF1α启动子启动的三代CD19CAR序列；所述三代CD19CAR序列由CD19单链可变区、CD8α铰链区、CD28跨膜区和胞内区、41BB胞内区、以及CD3ζ胞内区串联构成。2.如权利要求1所述的质粒结构pLVX-H1-shRNA-EF1α-CD19，其特征在于，所述抗PD-1shRNA序列为PD1-1shRNA序列、PD1-4shRNA序列、抗PD1-8shRNA序列或抗PD1-10shRNA序列。3.如权利要求2所述的质粒结构pLVX-H1-shRNA-EF1α-CD19，其特征在于，所述抗PD-1shRNA序列为抗PD1-1shRNA序列，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。4.如权利要求2所述的质粒结构pLVX-H1-shRNA-EF1α-CD19，其特征在于，所述抗PD-1shRNA序列为抗PD1-8shRNA序列，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。5.如权利要求1所述的质粒结构pLVX-H1-shRNA-EF1α-CD19，其特征在于，所述质粒结构以三代CD19CAR序列的结构为信号传导结构域。6.如权利要求5所述的质粒结构pLVX...

【专利技术属性】
技术研发人员：张同存，顾潮江，潘丽娟，
申请(专利权)人：武汉波睿达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42