一种构建产黄素单核苷酸的工程菌株的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种构建产黄素单核苷酸的工程菌株的方法及其应用。构建产黄素单核苷酸的工程菌株的方法，采用合成生物学技术，在新构建或者已有的核黄素发酵菌内，调节细胞内黄素池组分及内膜分泌，新颖性地加入细胞膜间质内的酶催化步骤，实现了微生物发酵产高纯度的黄素单核苷酸。具体方法是(1)在核黄素发酵菌内，引入双功能酶——核黄素激酶/黄素腺嘌呤二核苷酸生成酶，将细胞内黄素池组分从核黄素转化为黄素腺嘌呤二核苷酸；(2)引入黄素腺嘌呤二核苷酸内膜转运蛋白，将细胞内的黄素腺嘌呤二核苷酸转运至细胞膜间质内；(3)引入5'‑核苷酸酶，将细胞膜间质内的黄素腺嘌呤二核苷酸裂解转化为黄素单核苷酸。在摇瓶发酵条件下，黄素单核苷酸的发酵纯度(占总黄素类化合物)高达92.4％。

【技术实现步骤摘要】
一种构建产黄素单核苷酸的工程菌株的方法及其应用
本专利技术涉及生物工程
，具体而言，涉及一种构建产黄素单核苷酸的工程菌的方法及其应用。
技术介绍
黄素单核苷酸(flavinmononucleotide，简称FMN)是一种用途广泛的昂贵化合物。在生物体内，黄素单核苷酸作为黄素蛋白(flavoprotein)的辅酶，参与细胞的氧化还原反应，在基础代谢中起重要作用。许多微生物及植物能够自身合成黄素类化合物，而高等动物只能从食物中摄取，当其缺乏时，可导致脱发、皮肤发炎、视力受损等病症。因而，黄素单核苷酸作为水溶性维生素，常常被用作临床药物、食品及饲料添加剂、食用色素等。此外，黄素单核苷酸具有氧化还原活性中心，是一种重要的电子传递载体，在环境产电菌的胞外电子传递中发挥重要作用。随着产电菌的电子传递机制揭示，研究者发现黄素单核苷酸是一种普遍的细胞色素辅酶，决定了产电菌的电子传递速率。增加体系中的黄素单核苷酸的浓度，可有效地加快产电菌在生物质发电、污水处理、土壤修复及净化过程中的催化速度。然而，目前黄素单核苷酸的商业产品价格高昂、纯度低，如Sigma-Aldrich的黄素单核苷酸产品：纯度≥70％，价格约1万元/克，严重制约了其在生物医药、食品、环境工程等领域的广泛应用。目前黄素单核苷酸的工业化生产，主要通过微生物发酵法与化学加工结合的方式实现。由微生物发酵法从碳源合成核黄素(riboflavin，简称RF)——黄素单核苷酸的生成前体。核黄素的磷酸化以生成黄素单核苷酸是通过化学加工完成的。该化学过程能耗大，且伴有多种副产物积累，如黄素单核苷酸的同分异构化合物、黄素-二磷酸、黄素-多磷酸等；产品中混有残余的反应物等缺点。将黄素单核苷酸从这些副产物中提纯出来，其工艺复杂、成本昂贵，造成了从前体化合物核黄素到黄素单核苷酸的价格近1000倍的激增，及生产高纯度黄素单核苷酸的技术瓶颈。然而，目前未有报道微生物发酵生产黄素单核苷酸的工作，这主要是以下几个难点造成的。传统的代谢工程改造菌，以“胞内过量积累进而分泌终产物”为常规策略，然而该策略对细菌产黄素单核苷酸很难适用。细菌内的黄素池(flavinpool)含有三种化学结构非常类似、代谢路径紧邻的化合物，包括核黄素、黄素单核苷酸、黄素腺嘌呤二核苷酸(flavinadeninedinucleotide，简称FAD)。大部分的原核细菌内存在一种双功能酶(RF激酶/FAD合成酶，由ribC或者ribF编码)，将核黄素先转化为黄素单核苷酸，再继续催化为黄素腺嘌呤二核苷酸，使得其细胞内难以特异性得积累黄素单核苷酸。而按照传统的代谢工程思路——以细胞质为目标产物分泌前的过量积累空间，黄素单核苷酸难以特异性的积累，无法避免其他黄素类化合物的共同积累并形成副产物，最终降低分泌至细胞外的产品的纯度。与此同时，目前也未有报道能特异性分泌黄素单核苷酸的转运蛋白。因此，“细胞内过量积累、分泌”的常规基因工程思路难以实现黄素单核苷酸的微生物发酵生产。
技术实现思路
本专利技术的目的在于构建产黄素单核苷酸的工程菌株的方法,在细菌内建立黄素单核苷酸的从头合成代谢路径，构建的产黄素单核苷酸工程菌株实现了从核黄素至黄素单核苷酸的合成及特异性胞外分泌。为实现上述目的，采用的以下技术方案：一种构建产黄素单核苷酸的工程菌株的方法，该方法的具体步骤包括:(1)在核黄素发酵菌内，引入核黄素激酶/黄素腺嘌呤二核苷酸生成酶的双功能酶基因，生成的核黄素激酶/黄素腺嘌呤二核苷酸生成酶，将细胞内黄素池组分从核黄素转化为黄素腺嘌呤二核苷酸；(2)在步骤(1)获得的具有双功能酶的核黄素发酵菌内，引入黄素腺嘌呤二核苷酸内膜转运蛋白基因，生成的黄素腺嘌呤二核苷酸内膜转运蛋白将细胞内的黄素腺嘌呤二核苷酸转运至细胞膜间质内；(3)在步骤(2)获得的具有黄素腺嘌呤二核苷酸内膜转运蛋白的核黄素发酵菌内，引入5'-核苷酸酶基因，生成的5'-核苷酸酶，将细胞膜间质内的黄素腺嘌呤二核苷酸裂解催化为黄素单核苷酸。如上所述方法，优选地，所述核黄素发酵菌的构建如下：在宿主细胞内引入经过密码子优化的枯草杆菌的核黄素合成蛋白RibA、RibD、RibE、RibH的基因片段，并由组成型启动子或可诱导型启动子控制表达。如上所述方法，优选地，所述RibA、RibD、RibE、RibH的基因片段的核苷酸序列如SEQIDNo.1、2、3、4所示。如上所述方法，优选地，所述诱导型启动子的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示。如上所述方法，优选地，所述宿主细胞选自大肠杆菌(Escherichiacoli)，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，产氨短杆菌(Corynebacteriumammoniagenes)，荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)，棉病囊菌(Ashbyagossypii)，阿舒假囊酵母(Eremotheciumashbyii)，季也蒙毕赤酵母(Pichiaguilliermondii)，无名假丝酵母菌。如上所述方法，优选地，所述核黄素激酶/黄素腺嘌呤二核苷酸生成酶基因来自于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的ribC基因，所述ribC基因的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示。如上所述方法，优选地，所述的黄素腺嘌呤二核苷酸内膜转运蛋白基因来自于希瓦氏菌(Shewanellaoneidensis)的黄素腺嘌呤二核苷酸内膜转运酶基因SO_0702，其核苷酸序列如SEQIDNo.7所示。如上所述方法，优选地，所述的5'-核苷酸酶基因来源于希瓦氏菌(Shewanellaoneidensis)的ushA基因,其核苷酸序列如SEQIDNo.8所示。如上所述方法，优选地，控制所述黄素腺嘌呤二核苷酸内膜转运蛋白基因和5'-核苷酸酶基因的表达的启动子序列如SEQIDNo.9。一种合成核黄素单核苷酸的方法，所述方法将如上方法构造的产黄素单核苷酸的工程菌株，在有氧条件下进行发酵培养，生产核黄素单核苷酸。其中，已知的任何有氧发酵模式均适合实现本专利技术，如分批发酵、分批补料发酵或连续发酵法等。在发酵中，常规的培养基均将适合实现本专利技术，培养基中含有碳源、氮源、维生素、无机盐及菌株生长所需的其他各种成分。一种发酵培养基，所述发酵培养基用于如上所述方法构造的产黄素单核苷酸的工程菌株合成核黄素单核苷酸，所述发酵培养基的配方为每升溶液中含有12gNa2HPO4、6gKH2PO4、0.5gNaCl、1gNH4Cl、0.24gMgSO4、11.1mgCaCl2、2g尿素、15g木糖、10mL维生素溶液、10mL微量元素溶液、1g酪蛋白水解物、50mg卡那霉素、34mg氯霉素、2.4mg异丙基硫代半乳糖苷、4.6μg无水四环素；其中，所述微量元素溶液的配方为每升溶液中含有1.5g次氮基三乙酸、0.1gMnCl2·4H2O、0.3gFeSO4·7H2O、0.17gCoCl2·6H2O、0.1gZnCl2、0.04gCuSO4·5H2O、0.005gAlK(SO4)2·12H2O、0.005gH3BO3、0.09gNa2MoO4、0.12gNiCl2；所述维生素溶液的配方为每升溶液中含有0.002g生物素、0.002g叶酸、0.02g吡哆素盐酸盐、0.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种构建产黄素单核苷酸的工程菌株的方法，其特征在于，该方法的具体步骤包括:(1)在核黄素发酵菌内，引入核黄素激酶/黄素腺嘌呤二核苷酸生成酶的双功能酶基因，生成的核黄素激酶/黄素腺嘌呤二核苷酸生成酶，将细胞内黄素池组分从核黄素转化为黄素腺嘌呤二核苷酸；(2)在步骤(1)获得的具有双功能酶的核黄素发酵菌内，引入黄素腺嘌呤二核苷酸内膜转运蛋白基因，生成的黄素腺嘌呤二核苷酸内膜转运蛋白将细胞内的黄素腺嘌呤二核苷酸转运至细胞膜间质内；(3)在步骤(2)获得的具有黄素腺嘌呤二核苷酸内膜转运蛋白的核黄素发酵菌内，引入5'‑核苷酸酶基因，生成的5'‑核苷酸酶，将细胞膜间质内的黄素腺嘌呤二核苷酸裂解催化为黄素单核苷酸。

【技术特征摘要】
1.一种构建产黄素单核苷酸的工程菌株的方法，其特征在于，该方法的具体步骤包括:(1)在核黄素发酵菌内，引入核黄素激酶/黄素腺嘌呤二核苷酸生成酶的双功能酶基因，生成的核黄素激酶/黄素腺嘌呤二核苷酸生成酶，将细胞内黄素池组分从核黄素转化为黄素腺嘌呤二核苷酸；(2)在步骤(1)获得的具有双功能酶的核黄素发酵菌内，引入黄素腺嘌呤二核苷酸内膜转运蛋白基因，生成的黄素腺嘌呤二核苷酸内膜转运蛋白将细胞内的黄素腺嘌呤二核苷酸转运至细胞膜间质内；(3)在步骤(2)获得的具有黄素腺嘌呤二核苷酸内膜转运蛋白的核黄素发酵菌内，引入5'-核苷酸酶基因，生成的5'-核苷酸酶，将细胞膜间质内的黄素腺嘌呤二核苷酸裂解催化为黄素单核苷酸。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核黄素发酵菌的构建如下：在宿主细胞内引入经过密码子优化的枯草杆菌的核黄素合成蛋白RibA、RibD、RibE、RibH的基因片段，并由组成型启动子或诱导型启动子控制表达。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述RibA、RibD、RibE、RibH的基因片段的核苷酸序列如SEQIDNo.1、2、3、4所示。4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述诱导型启动子的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示。5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞选自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、产氨短杆菌、荧光假单胞菌、棉病囊菌、阿舒假囊酵母、季也蒙毕赤酵母或无名假丝酵母菌中的任一种。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核黄素激酶/黄素腺嘌呤二核苷酸生成酶基因来自于枯草芽孢杆菌的ribC基因，所述ribC基因的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示。7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的黄素腺嘌呤二核苷酸内膜转运蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：王华，杨昀，郭林，
申请(专利权)人：北京航空航天大学，
类型：发明
国别省市：北京,11