激肽释放酶7在皮肤创伤愈合中的应用制造技术

本发明专利技术提供激肽释放酶7在创伤愈合中的应用。本发明专利技术人利用人表皮细胞分泌制备激肽释放酶7，分离纯化后，加入体外培养的人类原代表皮细胞培养液中，可加快表皮细胞生长，与普通培养基相比，表皮贴壁更快，生长更迅速，生长状态良好。表皮细胞划痕结果表明，加入激肽释放酶7后，细胞迁移速度快，在60h左右即可恢复90％左右细胞汇合度。本发明专利技术为临床治疗皮肤创伤提供了更多选择。将激肽释放酶7制成外用药剂，可以加快愈合速度、提高愈合效果，将在皮肤创伤愈合领域发挥重要作用。

Application of kallikrein 7 in skin wound healing

The invention provides the application of kallikrein 7 in wound healing. The present invention uses human epidermal cells to secrete and prepare kallikrein 7. After isolation and purification, it can be added to the culture medium of human proto-representative skin cells cultured in vitro to accelerate the growth of epidermal cells. Compared with ordinary medium, the epidermis adheres faster, grows faster and grows well. Scratch test of epidermal cells showed that KL7 could accelerate cell migration and restore about 90% cell convergence within 60 hours. The invention provides more choices for clinical treatment of skin wounds. It can accelerate the healing speed and improve the healing effect, and will play an important role in the field of skin wound healing.

【技术实现步骤摘要】
激肽释放酶7在皮肤创伤愈合中的应用
本专利技术属于生物医学领域，具体涉及激肽释放酶在创伤愈合中的应用，还涉及用于创伤愈合的含有该细胞因子的组合物。
技术介绍
皮肤是人体面积最大的器官，具有阻挡异物和防止病原体入侵的屏障保护功能，还具有排汗、感觉冷热和压力等的重要生理功能，同时皮肤又是机体免疫系统的重要组成部分，任何原因造成的皮肤连续性被损伤以及缺失性损伤都会产生创口的急慢性感染及其相应的并发症。由于皮肤烧烫伤、炎症、溃疡以及术后等原因造成的皮肤损伤既影响美观也影响人们的生活质量，甚至严重时，如深度的大面积烧烫伤，皮肤失去屏障保护作用，致使大量细菌通过皮肤侵入人体，引发全身感染而导致死亡。因此创伤愈合在现实生活及临床工作中都有着重要的现实意义。创伤愈合的一般生物学过程主要包括炎症反应、细胞增殖修复和组织的成熟与重建这三个紧密联系的阶段。研究表明，细胞因子在创伤愈合过程中能够发挥一定的作用：组织对创口的即刻反应是形成血凝块以阻止出血，同时释放炎症细胞因子以调节血流量，并吸引淋巴细胞核巨噬细胞对抗感染，刺激血管形成和胶原沉积，导致了高度血管化，富含细胞的肉芽组织形成。细胞因子作为药物可加速创伤组织修复，并逆转不良修复状态。激肽释放酶主要分为两大类：即血浆激肽释放酶(PK)和组织激肽释放酶(TK)。TKs在体内分布较广泛，目前广泛认为人组织激肽释放酶基因家族已发现至少15个，即KLKl～KLKl5。越来越多的报道证实，人组织激肽释放酶具有多种生理功能，例如通过直接激活蛋白酶激活受体1，促进皮肤创面愈合和角化细胞迁移。人激肽释放酶7(hKLK7)，在皮肤、中枢神经系统高表达，主要通过激肽发挥作用，激肽受体主要有B1R和B2R两种受体。B1R受体在正常组织中少有表达，但在炎症及组织损伤时表达上调，B1R在毛细血管增殖方面起作用，而B2R则在激肽介导的细胞迁移和凋亡方面起重要作用，可显著增加神经胶质细胞的转移及侵犯。目前，尚未有将激肽释放酶7直接用于皮肤创伤愈合中的相关研究的报道。如果将激肽释放酶7，特别是人激肽释放酶7用于创伤愈合的治疗，将具有十分广阔的应用前景。
技术实现思路
本专利技术人在研究中发现激肽释放酶7(KLK7)可由表皮细胞分泌，并在促进创口的愈合过程中发挥作用。因此，本专利技术第一个目的是提供激肽释放酶7在创伤愈合中的应用。具体表现在，促进表皮细胞生长和迁移；促进真皮成纤维细胞增殖和迁移。本专利技术将激肽释放酶7分离纯化后，加入体外培养的人类原代表皮细胞培养液中，可加快表皮细胞生长，与普通培养基相比，表皮贴壁更快，生长更迅速，生长状态良好，一般3-4天细胞汇合度即可达到90％左右。表皮细胞划痕结果表明，加入激肽释放酶7后，细胞迁移速度快，在60h左右即可恢复90％左右细胞汇合度。将人激肽释放酶7加入体外培养的人真皮成纤维细胞培养液中，与普通培养液相比真皮细胞状态更好，生长迅速，可以促进真皮成纤维细胞增殖。真皮成纤维细胞划痕处理后，加入激肽释放酶7比不加该因子的细胞迁移速度快、划痕处细胞状态好、划痕恢复所需时间短。大鼠皮肤烫伤模型中，创口处滴加激肽释放酶7，与不加激肽释放酶7的创口相比，炎症反应概率降低，伤口结痂迅速，愈合良好，愈后皮肤平整，疤痕浅。综上研究结果可知，激肽释放酶7在创伤愈合中可发挥重要作用。本专利技术第二个目的是提供一种利用表皮细胞制备激肽释放酶7的方法。具体是：用人皮肤表皮细胞培养基培养人原代表皮细胞，隔天换液，表皮细胞4-5天进行传代，回收细胞培养上清液，上清液中含有人激肽释放酶7。所述表皮细胞培养基配方为：角质无血清培养基:DMEM培养基:Ham’sF-12培养基＝2:1:1、终浓度1.5mM的200mML-谷氨酰胺、终浓度25μg/ml的牛垂体提取物、终浓度0.2ng/ml的表皮生长因子、0.4mM/500ml的氯化钙。说明本专利技术方法可以成功利用培养过人表皮细胞的培养基制备人激肽释放酶7。本专利技术第三个目的是提供一种用于创口愈合的、含激肽释放酶7的药剂。鉴于激肽释放酶7在创口愈合中的作用，激肽释放酶7可做成外用药剂用于临床抗炎抗感染、促进伤口愈合等。所述药剂包含细胞因子激肽释放酶7及其他辅助成分；所述药剂为喷剂、滴剂、药膏、凝胶、敷料及其他外用剂型。涂敷于伤口部分，加速创伤愈合，适用于临床治疗。此外，所述药剂也可以是将激肽释放酶7加在现有外用抗炎药物中，发挥辅助作用，诱导细胞增殖分化，促进创伤愈合。本专利技术具有如下有益效果：1、本专利技术人首次发现人表皮细胞可以分泌激肽释放酶7，并利用人表皮细胞可以成功制备激肽释放酶7。为激肽释放酶7的广泛应用，提供了基础。2、本专利技术首次明确了激肽释放酶7在创伤愈合中的作用。激肽释放酶7可以促进表皮细胞生长，加快细胞迁移速度；并可以促进真皮成纤维细胞增殖、加快细胞迁移速度；划痕处表皮细胞及真皮细胞状态好、划痕恢复所需时间短。将激肽释放酶7用于大鼠皮肤烫伤的创口处，可以加速结痂、减少炎症反应、促进愈合，愈后皮肤平整，疤痕浅。3、本专利技术为临床治疗皮肤创伤提供了更多选择。将激肽释放酶7制成外用药剂，可以加快愈合速度、提高愈合效果，将在皮肤创伤愈合领域发挥重要作用。附图说明图1为实验例1划痕处不同时间点真皮细胞生长迁移的情况。其空白对照组中每孔加入3mlDMEM培养基；阴性对照组12.5μg/ml中每孔加入3ml蛋白浓度为12.5μg/ml的浓缩人皮肤表皮细胞培养基；阴性对照组25μg/ml中每孔加入3ml蛋白浓度为25μg/ml的浓缩人皮肤表皮细胞培养基；实验组12.5μg/ml中每孔加入3ml蛋白浓度为12.5μg/ml的浓缩激肽释放酶7培养基；实验组25μg/ml中每孔加入3ml蛋白浓度为25μg/ml的浓缩激肽释放酶7培养基。图2为实验1划痕后划痕处不同时间点表皮细胞生长迁移的情况。其中空白对照组中每孔加入3ml人皮肤表皮细胞培养基；阴性对照组12.5μg/ml中每孔加入3ml蛋白浓度为12.5μg/ml的浓缩人皮肤表皮细胞培养基；阴性对照组25μg/ml中每孔加入3ml蛋白浓度为25μg/ml的浓缩人皮肤表皮细胞培养基；实验组12.5μg/ml中每孔加入3ml蛋白浓度为12.5μg/ml的浓缩激肽释放酶7培养基；实验组25μg/ml中每孔加入3ml蛋白浓度为25μg/ml的浓缩激肽释放酶7培养基。图3为winstar品系大鼠烫伤后烫伤处不同时间点伤口修复愈合情况。图中空白对照组烫伤后不做处理；阴性对照组25μg/ml烫伤后滴加蛋白浓度为25μg/ml的浓缩人皮肤表皮细胞培养基；实验组25μg/ml烫伤后滴加蛋白浓度为25μg/ml的浓缩激肽释放酶7培养基。注：做实验当天记为Day0，实验第二天记为Day1，以此类推。Day6补加20μl。Day8补加20μl。具体实施方式下面结合具体实施例和附图对本专利技术的技术方案及其所产生的技术效果做进一步的阐述，下述说明仅是为了解释本专利技术，但不以任何方式对本专利技术加以限制，基于本专利技术所作的任何变换或替换，均属于本专利技术的保护范围。本专利技术所述方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。本专利技术所述试剂若无特殊说明均为市售试剂。实施例1、利用人表皮细胞制备人激肽释放酶7步骤如下：(1)用人皮肤表皮细胞培养基(DMEM培养基:Ham’sF-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.激肽释放酶7在创伤愈合中的应用。

【技术特征摘要】
1.激肽释放酶7在创伤愈合中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征是，所述应用包括：促进表皮细胞生长和迁移；促进真皮成纤维细胞增殖和迁移。3.如权利要求1或2所述的应用，其特征是，所述激肽释放酶7为人激肽释放酶7。4.一种利用人表皮细胞制备人肽释放酶7的方法，其特征是，用人皮肤表皮细胞培养基培养人原代表皮细胞，隔天换液，表皮细胞4-5天进行传代，回收细胞培养上清液，上清液中含有人激肽释放酶7；5.如权利要求4所述的利用人表皮细胞制备人肽释放酶7的方法，其特征是，所述表皮细胞培养基配方为：角质无血清培养基:DMEM培养基:Ham’sF-12培养基＝2:1:1、终浓度1.5...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴训伟，邢志青，张平，张甜甜，李霄，王红丽，王杰，
申请(专利权)人：济南磐升生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37