一种测定肽分子量的一体式阀切换二维液相色谱及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种测定肽分子量的一体式阀切换二维液相色谱及其应用，该二维液相色谱包括第一维液相色谱柱、第二维液相色谱柱、二维切换装置、第二维进样装置和样品环；其中的第一维液相色谱柱和第二维液相色谱柱与二维切换装置连接；第二维液相色谱柱为凝胶色谱柱；二维切换装置和第二维进样装置都是多通阀，样品环连接在第二维进样装置的两个阀口之间。本发明专利技术的二维液相色谱将凝胶色谱柱作为第二维液相色谱，可以借助于第一维液相色谱的高效分离，对目标组分或全组分进行一次预分离，再经第二维凝胶色谱分析测定其肽分子量情况，可大大降低被分析组分在凝胶柱中的复杂性，从而提高其分离效率和分析准确性。

An integrated valve switching two-dimensional liquid chromatography for the determination of peptide molecular weight and its application

The invention discloses an integrated valve switching two-dimensional liquid chromatography for determining the molecular weight of peptides and its application. The two-dimensional liquid chromatography comprises a first-dimensional liquid chromatographic column, a second-dimensional liquid chromatographic column, a two-dimensional switching device, a second-dimensional sampling device and a sample ring, wherein the first-dimensional liquid chromatographic column and a second-dimensional liquid chromatographic column are connected with a sample ring. The two-dimensional switching device is connected; the second-dimensional liquid chromatographic column is a gel chromatographic column; the two-dimensional switching device and the second-dimensional sampling device are multi-valve, and the sample ring is connected between the two valve ports of the second-dimensional sampling device. The two-dimensional liquid chromatography of the present invention takes the gel chromatographic column as the second-dimensional liquid chromatography. By means of the high-performance separation of the first-dimensional liquid chromatography, the target component or the whole component can be pre-separated once, and the molecular weight of the peptide can be determined by the second-dimensional gel chromatographic analysis, thus greatly reducing the duplication of the analyzed component in the gel column. Therefore, the separation efficiency and accuracy can be improved.

【技术实现步骤摘要】
一种测定肽分子量的一体式阀切换二维液相色谱及其应用
本专利技术属于仪器分析领域，具体涉及一种测定肽分子量的一体式阀切换二维液相色谱及其应用。
技术介绍
凝胶液相色谱被广泛应用于蛋白、肽分子量的测定或酶解产物中分子量分布的测定。然而随着样品复杂性的逐渐升高，传统一维凝胶液相色谱的单柱分析因其分辨率较低，色谱峰常呈现共洗脱的现象，与其他物质的色谱峰存在不同程度地重叠，无法满足样品的分析需求。为改善色谱分离效果，科研工作者报道了一种同系列不同规格凝胶液相色谱柱多柱串联同时进行色谱分离的方法，由于该方法采用直接串联的方法连接凝胶色谱柱，很大程度上仍受限于凝胶色谱柱本身，因此只能在一定程度上提高其色谱分辨率，此外，采用不同规格的多柱串联，存在不同溶质在不同柱内的串峰现象，即原本在第一根色谱柱中先出峰的溶质可能由于非筛分效应在第二根柱内后出峰，此外，多柱串联时由于不同色谱柱的分子量有效分离区间不一致，可能造成未知的溶质分子截留，即大分子物质可能在后续的小分子色谱柱中被截留，为此发展一种新型的肽分子量测定方法是当下亟需解决的问题。二维液相色谱作为一种新兴的色谱分离技术，其分离效率远高于传统一维液相色谱，但由于凝胶色谱的分析速度受到色谱柱材料最大压降限制，无法对其进行快速分析，且其分辨率极低，因此其常作为第一维液相色谱使用，而极少将其作为第二维液相色谱，此外，凝胶色谱进行肽分子量测定时，若无激光散射仪辅助进行粒径和分子量测定，则需要创建分子量测定的标准曲线，而当前现有二维液相色谱方案均缺少对第二维液相色谱进样的支持，因此凝胶色谱在第二维液相色谱的应用和发展严重受阻。专利技术内容为了克服现有凝胶色谱测定肽分子量时存在的分辨率低、第二维凝胶色谱无法直接进样创建标准曲线的问题，本专利技术的首要目的在于提供一种以凝胶色谱为第二维液相色谱的二维液相色谱。将凝胶色谱柱作为第二维液相色谱，可以借助于第一维液相色谱的高效分离，对目标组分或全组分进行一次预分离，再经第二维凝胶色谱分析测定其肽分子量情况，可大大降低被分析组分在凝胶柱中的复杂性，从而提高其分离效率和分析准确性。本专利技术的另一目的在于提供上述二维液相色谱在测定肽分子量中的应用，其分析方法以反相液相色谱、离子色谱或亲水作用色谱为第一维液相色谱，以凝胶色谱为第二维液相色谱分析方法，再辅以第二维液相色谱的进样支持用于创建凝胶色谱分子量校正曲线。在进行样品分析时，该方法利用第一维液相色谱对样品进行预先分离以降低流入凝胶色谱分析的样品复杂性和分析难度，从而提高了目标组分或全组分的分子量测定准确性。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种二维液相色谱，包括第一维液相色谱柱、第二维液相色谱柱、二维切换装置、第二维进样装置和样品环；所述的第一维液相色谱柱和第二维液相色谱柱与二维切换装置连接；所述的第二维液相色谱柱为凝胶色谱柱；所述的二维切换装置和第二维进样装置都是多通阀，样品环连接在第二维进样装置的两个阀口之间；所述的二维切换装置优选十通阀，所述的第二维进样装置至少为六通阀；所述的二维液相色谱还包括色谱泵、进样装置和检测器；第二维液相色谱需要装载标准品时，将标准品通过第二维进样装置与样品环连接的阀口注入样品环中；然后转动第二维进样装置切换一次卡位，各阀口的连通关系发生改变；第二维液相色谱的流动相依次流经二维切换装置、第二维进样装置、样品环，并再次流回二维切换装置，最终将样品环中的标准品送入第二维液相色谱柱中进行分析，经检测后建立标准曲线；该环节与第一维液相色谱柱无关；进行未知样品的肽分子量检测时，先将未知样品经第一维液相色谱柱分析，经检测后，细分的目标组分经二维切换装置流向第二维进样装置的样品环中，该环节也称二维采样；然后转动二维切换装置切换一次卡位，各阀口的连通关系发生改变；第二维液相色谱的流动相依次流经二维切换装置、第二维进样装置、样品环，并再次流回二维切换装置，最终将样品环中的目标组分送入第二维液相色谱柱中进行分析，经检测和计算测得肽分子量；所述的第一维液相色谱柱为可在高水相条件下进行样品分析的反相液相色谱柱、离子液相色谱柱或亲水作用色谱柱；所述的色谱泵是多泵或单泵，可以是高压、中压或低压液相泵；所述的检测器为紫外检测器、示差检测器或激光散射仪。上述的二维液相色谱可用于肽分子量的测定，测定方法包括以下步骤：(1)肽分子量标准品通过第二维液相色谱柱的单维分析得到其相应的保留时间，并以此作分子量对数-保留时间之间的关系曲线图，通过线性拟合得出二者之间的量化关系(即为分子量标准品校正曲线)；(2)样品首先经过第一维液相色谱柱的预分离得到不同的流出组分；(3)流出组分(流出峰)在二维切换装置被切割并逐个转移至第二维液相色谱柱；(4)第二维液相色谱柱对转移进来的组分进行色谱分离，检测样品流出组分(流出峰)的保留时间，结合步骤(1)中的分子量标准品校正曲线即可得出其对应分子量大小。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：1、本专利技术的肽分子量二维液相色谱通过第一维液相色谱柱在高水相下对样品进行高效分离，大大降低了目标分析组分在凝胶色谱中的样品复杂性，改善了其分离效果，进而提高了分子量分析的准确性。2、本专利技术的肽分子量二维液相色谱实现了第二维液相色谱的直接进样，在建立分子量标准品校正曲线时可直接对第二维液相色谱进行单独进样分析，此时标准品的分析不需要经过第一维液相色谱，解决了第二维液相色谱的进样缺陷问题。此外，两个维度的液相色谱均含有进样器，可通过二维切换部分的切换轻松实现两个维度液相色谱的独立运行，实现一机两用，大大提高了仪器的利用率。3、本专利技术的肽分子量二维液相色谱既可通过中心切割分析对一维液相色谱目标流出组分的分子量、分子量分布、接枝情况等进行分析，亦可通过全二维分析对一维液相色谱的全部流出组分进行分子量、分子量分布、支链分布、组成分布情况等分析，此外，全二维分析图谱还可进一步提供肽混合样品在两个维度上的分布情况，可作为其分离和分析方案的参考。4、本专利技术的肽分子量二维液相色谱使用凝胶色谱作为第二维液相色谱，可以很好的兼容高水相流动相，有利于二维液相色谱与柱后生物酶催化反应的在线连接，有利于促进在线生物活性物质分离与检测的发展。附图说明图1是实施例的二维液相色谱处于标准品装载和分析状态时的连接示意图；图2是实施例的二维液相色谱处于二维采样和分析状态时的连接示意图；其中，a-色谱泵；b-进样装置；c-第一维液相色谱柱；d-二维切换装置；e-色谱泵；f-进样装置；g-样品环；h-第二维液相色谱柱；i-检测器。图3是实施例的标准品校正曲线。图4是实施例的样品C18单维洗脱曲线。图5是实施例样品的中心切割二维分析图。图6是对比例的样品色谱分离图。具体实施方式下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。实施例一种二维液相色谱，如图1和图2所示，包括第一维液相色谱柱c(4.6×250mmC18分析色谱柱(大连依利特SinoChromODS-AP))、第二维液相色谱柱h(7.8×300mm凝胶色谱分析柱(TosohG2000SWXL))、二维切换装置d(电动十通阀(DIONEXPD105-702))、第二维进样装置f(六通阀)和样品环g；所述的第一维液相色谱柱c和第二维液相本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种二维液相色谱，其特征在于包括第一维液相色谱柱、第二维液相色谱柱、二维切换装置、第二维进样装置和样品环；所述的第一维液相色谱柱和第二维液相色谱柱与二维切换装置连接；所述的第二维液相色谱柱为凝胶色谱柱；所述的二维切换装置和第二维进样装置都是多通阀，样品环连接在第二维进样装置的两个阀口之间；第二维液相色谱需要装载标准品时，将标准品通过第二维进样装置与样品环连接的阀口注入样品环中；然后转动第二维进样装置切换一次卡位，各阀口的连通关系发生改变；第二维液相色谱的流动相依次流经二维切换装置、第二维进样装置、样品环，并再次流回二维切换装置，最终将样品环中的标准品送入第二维液相色谱柱中进行分析；进行未知样品的肽分子量检测时，先将未知样品经第一维液相色谱柱分析，经检测后，细分的目标组分经二维切换装置流向第二维进样装置的样品环中，该环节也称二维采样；然后转动二维切换装置切换一次卡位，各阀口的连通关系发生改变；第二维液相色谱的流动相依次流经二维切换装置、第二维进样装置、样品环，并再次流回二维切换装置，最终将样品环中的目标组分送入第二维液相色谱柱中进行分析。

【技术特征摘要】
1.一种二维液相色谱，其特征在于包括第一维液相色谱柱、第二维液相色谱柱、二维切换装置、第二维进样装置和样品环；所述的第一维液相色谱柱和第二维液相色谱柱与二维切换装置连接；所述的第二维液相色谱柱为凝胶色谱柱；所述的二维切换装置和第二维进样装置都是多通阀，样品环连接在第二维进样装置的两个阀口之间；第二维液相色谱需要装载标准品时，将标准品通过第二维进样装置与样品环连接的阀口注入样品环中；然后转动第二维进样装置切换一次卡位，各阀口的连通关系发生改变；第二维液相色谱的流动相依次流经二维切换装置、第二维进样装置、样品环，并再次流回二维切换装置，最终将样品环中的标准品送入第二维液相色谱柱中进行分析；进行未知样品的肽分子量检测时，先将未知样品经第一维液相色谱柱分析，经检测后，细分的目标组分经二维切换装置流向第二维进样装置的样品环中，该环节也称二维采样；然后转动二维切换装置切换一次卡位，各阀口的连通关系发生改变；第二维液相色谱的流动相依次流经二维切换装置、第二维进样装置、样品环，并再次流回二维切换装置，最终将样品环中的目标组分送入第二维液相色谱柱中进行分析。2.根据权利要求1所述的二维液相色谱，其特征在于：所述的二维切换装置为十通阀。3.根据权利要求1所述的二维液相色谱，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵谋明，徐巨才，郑淋，苏国万，何伟炜，陈雅君，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东,44