大肠杆菌O157:H7单个活菌的快速检测方法及试剂盒技术

一种大肠杆菌O157:H7单个活菌快速灵敏定量检测方法及检测试剂盒。采用增菌、富集和纯化等前处理方法将大肠杆菌O157:H7进行富集纯化，然后采用特异性免疫荧光抗体标记大肠杆菌O157:H7，并辅以膜选择通透性荧光染料来标记区分死菌和活菌，再进行流式分析技术检测，通过计数不同荧光信号，直接获得大肠杆菌O157:H7活菌的浓度。本发明专利技术的检测方法具有准确定量、特异性强、灵敏度高、检测时间短、操作简便、可区分死活菌的优点。

【技术实现步骤摘要】
大肠杆菌O157:H7单个活菌的快速检测方法及试剂盒
：本专利技术属于食品微生物检测领域，涉及大肠杆菌O157:H7的快速定量检测，特别是单个活菌的快速检测方法及试剂盒。
技术介绍
：大肠杆菌O157:H7(EscherichiacoliO157:H7)是一种重要的食源性致病菌，属于肠杆菌科埃希氏菌属，是肠出血性大肠杆菌中最具代表性的血清型。它的感染剂量非常低，最低10个活菌就可能感染致病，主要引起人的出血性腹泻和肠炎，且并发溶血性尿毒综合症、血栓性血小板减少性紫癜等，严重的可致人死亡。因此能够快速准确的定量检测出食品和水中大肠杆菌O157:H7活菌，对食品安全和保障人民健康具有非常重要的意义。传统培养法检测大肠杆菌O157:H7耗时费力，需要18小时以上时间才能完成检测。现有的大肠杆菌O157:H7的快速检测技术存在以下缺点：1、不能区分死菌和活菌众所周知，只有活菌才有致病性，因此如果不清楚活菌量，即使是定量检测，也很难估计该菌的感染程度。但目前国内外主流技术，包括免疫学方法、分子生物学方法、液相芯片法和流式计数法等。不仅检测时间仍然较长，而且难以区分死活菌。因为，免疫学方法是通过抗原抗体相互反应的原理，它只能检测总的细菌抗原蛋白；而分子生物学方法是通过基因扩增原理，只能检测总的细菌核酸；液相芯片法是通过抗体捕获细菌抗原再通过抗体标记抗原进行检测，只能检测得出细菌表面抗原浓度；先前建立的流式计数法只能通过抗体捕获细菌，再通过细菌核酸染料进行标记，只能检测得到总的细菌浓度。以上方法均不能区分死菌和活菌。2、检测灵敏度低于该菌的最低感染剂量(10CFU)，更不能检出单个活菌大肠杆菌O157:H7的最低感染剂量是10CFU，现有液相芯片法和流式计数法的检测限都在103CFU/mL以上，无法满足大肠杆菌O157:H7检测的基本需要。比如，中国专利CN201611201541.6，用流式细胞术快速检测大肠杆菌O157:H7。操作步骤是将大肠杆菌O157:H7(E.coliO157:H7)用SybrGreenI原液进行染色后，再用B细胞捕获不同浓度大肠杆菌O157:H7，通过流式细胞仪检测对应的荧光强度，建立回归方程，然后每次按照操作步骤检测得到B细胞捕获的待测大肠杆菌的荧光强度后，通过程计算得到大肠杆菌O157:H7浓度。但是，该方法检测到的大肠杆菌O157:H7是死菌和活菌的总浓度。此外，该专利的检测限是4.9×104CFU/mL。如果只是单个菌落，无法检出。又如，中国专利CN201110360550.0，公开了一种液相芯片检测大肠杆菌O157的方法未采用流式分析，利用液相芯片，也不能区分死菌和活菌；而且得到的检测结果不是绝对定量方法，是相对定量。另外，CN201110360550.0方法的检测限是103CFU/mL。而该菌的最低感染剂量是10CFU。所以，此方法很难实际应用。因此，快速检测，灵敏度高(检测限达到单个菌)，且能检出活菌数，是大肠杆菌O157:H7检测的实际需要，也是技术难点。
技术实现思路
：本专利技术的第一目的是提供一种大肠杆菌O157:H7单个活菌的快速灵敏定量检测方法，即，该方法必须能够区分死活菌，且检测限可以达到检测到单个活菌的灵敏程度。本专利技术的第二目的是提供达到上述目的的检测试剂盒。本方法具有三个技术关键点：一是如何富集纯化大肠杆菌O157:H7，二是如何特异地识别大肠杆菌O157:H7，三是如何准确区分大肠杆菌O157:H7中死活菌。针对上述问题，本专利技术人进行了如下工作：采用增菌液将大肠杆菌O157:H7进行富集。使用增菌液将原始大肠杆菌O157:H7菌液稀释成一系列不同浓度的菌液。浓度约为1CFU/mL，10CFU/mL，100CFU/mL，1000CFU/mL，10000CFU/mL，并对其进行平板计数。然后对上述不同浓度的菌液进行37℃培养，并每隔0.5h进行一次平板计数。绘制大肠杆菌O157:H7活菌浓度与培养时间的响应曲线，得回归方程如下：Y＝X/(2^(1.9919t-2.3391)*10)式中，Y为待测样品中大肠杆菌O157:H7的原始浓度，CFU/mL；X为流式分析仪检测出的大肠杆菌O157:H7浓度，CFU/mL；t为增菌培养时间，h。采用了偶联有绿色荧光染料的大肠杆菌O157:H7的抗体，对大肠杆菌O157:H7进行特异性荧光标记。通过比较了大肠杆菌O157单克隆抗体(MAB)和多克隆抗体(PAB)在本方法中的优劣，筛选出了效果最佳的抗体，并通过优化得到最佳的反应条件。采用了具有膜选择通透性的红色荧光染料，对死亡的大肠杆菌O157:H7进行荧光标记。并对其死活菌染色的准确性进行了验证。并优化了大肠杆菌O157:H7双荧光标记条件。据此，本专利技术首次建立了一种采用流式分析技术快速灵敏定量检测大肠杆菌O157:H7活菌的方法，其特征是：在进行检测之前，先对待检样品进行前处理；所述前处理是进行增菌、富集和纯化处理，使大肠杆菌O157:H7富集纯化。所述增菌，方法是将待测样品加入增菌液，37℃培养5h以上，然后过滤，收集滤液。可以使用本领域技术人员常用的各种培养液作为增菌液。优选的增菌液配方是：蛋白胨3～30g/L，牛肉粉0.5～5g/L，氯化钠0.5～5g/L，葡萄糖0.5～5g/L，pH7.2～7.6。所述富集，方法是将上述滤液离心，弃去上层液体，保留底部的沉淀所述纯化，方法是将上述沉淀加入PBS重悬沉淀，得到纯化的样品菌液。所述检测，是采用荧光双标记大肠杆菌O157:H7，再进行流式分析技术检测；通过计数不同荧光信号，直接获得大肠杆菌O157:H7活菌的浓度。所述荧光双标记，是进行特异性免疫荧光抗体标记，并辅以膜选择通透性荧光染料标记区分死菌和活菌。所述免疫荧光抗体是荧光发射光谱在501nm～540nm的绿色荧光染料通过化学基团交联的大肠杆菌O157多克隆抗体或单克隆抗体，可以特异性标记鉴定特异性标记大肠杆菌O157:H7；膜选择通透性荧光染料是荧光发射光谱在601nm～640nm的红色荧光染料，可以标记死的大肠杆菌O157:H7。所述区分死菌和活菌，方法如下：采用上述绿色荧光染料偶联的抗体对大肠杆菌O157:H7进行特异性标记，再采用上述膜选择通透性红色荧光染料将死亡的细菌进行标记，最后通过流式分析仪的荧光通道进行检测。比如，可以在纯化的菌液中加入偶联有异硫氰酸荧光素的大肠杆菌O157单克隆抗体(FITC-MAB)和碘化丙啶(PI)，混匀后孵育。如果仅检测到绿色荧光，则判定为检测到的细菌是大肠杆菌O157:H7活菌；如果同时检测到红色和绿色两种荧光，则判定为检测到的细菌是大肠杆菌O157:H7死菌；如果未检测到绿色荧光，则判定为不存在大肠杆菌O157:H7。所以，通过上述方法，即可完成大肠杆菌O157:H7死活菌的定性定量检测。所述流式分析仪检测：检测参数设定如下：激发光分别为450～500nm，分析速度为1～15μL/min，检测时间为15～300s，通过双荧光通道，分析计算大肠杆菌O157活菌浓度X。所述分析计算，按本领域常规方法，通常首先通过流式分析仪得出大肠杆菌O157:H7活菌个数和分析样品体积，从而计算得出流式分析仪检测出的大肠杆菌O157:H7浓本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种采用流式分析技术快速检测大肠杆菌O157:H7单个活菌的方法，其特征是：在进行检测之前，先对待检样品进行前处理；所述前处理是进行增菌、富集和纯化处理。

【技术特征摘要】
1.一种采用流式分析技术快速检测大肠杆菌O157:H7单个活菌的方法，其特征是：在进行检测之前，先对待检样品进行前处理；所述前处理是进行增菌、富集和纯化处理。2.权利要求1所述的方法，所述增菌，是将待测样品加入增菌液进行培养，然后过滤，收集滤液；所述富集，是将上述滤液离心，弃去上层液体，保留底部的沉淀；所述纯化，是将上述沉淀加入PBS重悬沉淀，得到纯化的样品菌液。3.权利要求1所述的方法，所述检测，是采用双荧光标记大肠杆菌O157:H7，再用流式分析仪进行流式分析技术检测；通过计数不同荧光信号，获得大肠杆菌O157:H7活菌的检测浓度。4.权利要求3所述的方法，待测样品中大肠杆菌O157:H7活菌的原始浓度按以下公式计算：Y＝X/(2^(1.9919t-2.3391)*10)式中，Y为待测样品中大肠杆菌O157:H7的原始浓度，CFU/mL；X为流式分析仪检测出的大肠杆菌O157:H7浓度，CFU/mL；t为增菌培养时间，h。5.权利要求3所述的方法，所述流式分析仪的技术指标是：荧光灵敏度<10MESF，颗粒尺寸<40nm，荧光分辨率...

【专利技术属性】
技术研发人员：隋志伟，刘思渊，王晶，
申请(专利权)人：中国计量科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京,11