一种鮟鱇鱼骨抗肿瘤十二肽的制备方法及应用技术

一种鮟鱇鱼骨抗肿瘤十二肽的制备方法及应用，它选用鮟鱇鱼骨作为原料，所述方法包括：a）碎料：用高速组织捣碎机将鮟鱇鱼骨进行捣碎处理，制成粉状和微颗粒状的鮟鱇鱼骨粉；b）酶解：选用中性蛋白酶对鮟鱇鱼骨粉进行酶解，制成鮟鱇鱼骨粉酶解液；c）超滤：将鮟鱇鱼骨粉酶解液加入超滤系统，用10KD、5KD、3KD的超滤膜进行超滤，收集>10KD、10‑5KD、5‑3KD和

Preparation and application of an anti tumor peptide twelve from fish bone

The preparation method and application of the fish bone antitumor twelve peptide used as raw material, the method includes: a) crushed material: using a high speed tissue crusher to mash the fish bone to make the powder and microgranular fishbone powder; b) enzyme solution: the neutral protease is used to carry out the fish bone powder. C) ultrafiltration: Ultrafiltration with 10KD, 5KD and 3KD ultrafiltration membrane to collect >10KD, 10 5KD, 5 3KD and 3KD.

【技术实现步骤摘要】
一种鮟鱇鱼骨抗肿瘤十二肽的制备方法及应用
本专利技术涉及的是一种鮟鱇鱼骨抗肿瘤十二肽的制备方法及应用，尤其是一种对前列腺癌细胞具有抑制作用的鮟鱇鱼骨抗肿瘤十二肽的制备方法及应用。
技术介绍
传统的治疗手段主要包括前列腺癌根治切除术、激素治疗、化疗、放射治疗等，但治疗后癌症很难根除，复发率极高。因此，从海洋中寻找一种高效、低毒和具有较强特异性的新型抗肿瘤药物具有重要的研究意义和临床意义。在水产品加工过程中，会产生大量的下脚料（包括鱼头、鱼皮、鱼鳍、鱼尾、鱼骨及其残留鱼肉），其质量约占原料鱼的30%～55%，不同部位胶原蛋白的含量从20%～50%不等。鮟鱇鱼（Lophiuslitulon）属冷温性底层鱼类，常栖伏海底，分布于北太平洋西部，我国产于东海北部、黄海及渤海。近年来我国鮟鱇鱼出口需求旺盛，产量和价格大幅增加，鮟鱇鱼出口己成为我国的新兴渔业。然而，在鮟鱇鱼的加工中，大量鱼皮被作为下脚料而废弃，这不仅污染了环境，也造成了资源的浪费。目前，为了提高鮟鱇鱼皮的经济附加值，已有学者开始研究从鮟鱇鱼加工副产物中提取硫酸皮肤素、硫酸软骨素、胶原蛋白等。活性肽是由两个或两个以上的氨基酸以肽键相连的化合物，在人体内起重要生理作用，发挥生理功能，如：调节体内的水分、电解质平衡；促进伤口愈合；修复细胞、改善细胞代谢，能起到防癌作用等。活性肽一般通过酶解生物活性材料获得，研究发现食物蛋白通过蛋白酶酶解方式，可以得到功能多样的活性多肽。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种通过蛋白酶对鮟鱇鱼鱼骨进行酶解以获得一种对前列腺癌细胞具有抑制作用的、提取的多肽得率高的鮟鱇鱼骨抗肿瘤十二肽的制备方法及应用。本专利技术的目的是通过如下技术方案来完成的，一种鮟鱇鱼骨抗肿瘤十二肽的制备方法，它选用鮟鱇鱼骨作为原料，所述的制备方法包括如下步骤：a）碎料：用高速组织捣碎机将鮟鱇鱼骨进行捣碎处理，制成粉状和微颗粒状的鮟鱇鱼骨粉；b）酶解：选用中性蛋白酶对鮟鱇鱼骨粉进行酶解，制成鮟鱇鱼骨粉酶解液；c）超滤：将鮟鱇鱼骨粉酶解液加入超滤系统，用10KD、5KD、3KD的超滤膜进行超滤，收集>10KD、10-5KD、5-3KD和<3KD分子量的酶解液，进行冷冻干燥，d）鮟鱇鱼酶解液过G-25洗脱液得到5个峰，经体外抗肿瘤实验筛选，峰2和峰3具有最高的抗肿瘤活性的，收集峰2和峰3，冷冻干燥，进一步分离纯化并用高效液相纯度检测；e）经过反相高效液相色谱(RT-HPLC)纯化及氨基酸序列检测：峰3用HPLC检测发现，该分子段只有1个洗脱峰，并进行氨基酸序列检测，其氨基酸序列为Met-Trp-Ile-Phe-His-Asp-Ser-Asp-Lys-Asn-Cys-Arg；制成鮟鱇鱼骨抗肿瘤十二肽产品。作为优选：所述的步骤b）酶解条件为：pH:7.0-7.5，温度：40-45℃，料液比：1:1，时间：5-7h,加酶量:1200-1500u/g；所述的步骤d）中，所述G-25凝胶分离是：将步骤c）获得的酶解液用蒸馏水进行溶解，离心，取上清液，过0.45μm微孔滤膜，取酶解液溶液1.5ml过SephadexG-25柱(90cm×115cm(ID))，用蒸馏水为洗脱液，平衡和洗脱；每管收集3ml，于λ280nm处检测，收集各峰洗脱液；所述的步骤e）中，所述反相高效液相色谱(RT-HPLC)是：即用RT-HPLC进行纯化，色谱条件:1)样品前处理:将样品用0.06%TFA的水溶解到0.6ml，离心（12000-14000RPM，离心10分钟）取上清；2)系统:Agilent1260HPLC；3)柱子:ZorbaxSB-C184.6X2505um；4)进样体积:80-100ul；5)缓冲液、平衡缓冲液:0.06%TFA洗脱缓冲液:0.05%TFA的乙腈；6)梯度:0%–0%B洗脱4分钟，0%–8%B洗脱25分钟，8%-100%B洗脱1分钟，100%-100%B洗脱5分钟；7)流速:1.0ml/min；8）检测:280nm/214nm。一种如上所述鮟鱇鱼骨抗肿瘤十二肽的应用，所述的鮟鱇鱼骨抗肿瘤十肽作为功能食品，用于前列腺癌患者的辅助功能性食品，对前列腺癌的抑制作用明显。本专利技术通过蛋白酶对鮟鱇鱼鱼骨粉状原料进行酶解以获得一种对前列腺癌细胞具有抑制作用的鮟鱇鱼骨抗肿瘤十肽产品，具有提取的多肽得率高等特点。附图说明图1是本专利技术所述鮟鱇鱼酶解液经过G—25洗脱液后的体外抗肿瘤实验筛选图。图2是本专利技术所述用HPLC检测所获得的分子段洗脱峰值图。图3是本专利技术所述十二肽对PC—3细胞增值活性的影响图。具体实施方式下面将结合具体实施例及试验检测图等对本专利技术作详细的介绍：本专利技术所述的一种鮟鱇鱼骨抗肿瘤十二肽的制备方法，它选用鮟鱇鱼骨作为原料，所述的制备方法包括如下步骤：a）碎料：用高速组织捣碎机将鮟鱇鱼骨进行捣碎处理，制成粉状和微颗粒状的鮟鱇鱼骨粉；b）酶解：选用中性蛋白酶对鮟鱇鱼骨粉进行酶解，制成鮟鱇鱼骨粉酶解液；c）超滤：将鮟鱇鱼骨粉酶解液加入超滤系统，用10KD、5KD、3KD的超滤膜进行超滤，收集>10KD、10-5KD、5-3KD和<3KD分子量的酶解液，进行冷冻干燥，d）鮟鱇鱼酶解液过G-25洗脱液得到5个峰，经体外抗肿瘤实验筛选，峰2和峰3具有最高的抗肿瘤活性的，收集峰2和峰3，冷冻干燥，进一步分离纯化并用高效液相纯度检测；e）经过反相高效液相色谱(RT-HPLC)纯化及氨基酸序列检测：峰3用HPLC检测发现，该分子段只有1个洗脱峰，并进行氨基酸序列检测，其氨基酸序列为Met-Trp-Ile-Phe-His-Asp-Ser-Asp-Lys-Asn-Cys-Arg；制成鮟鱇鱼骨抗肿瘤十二肽产品。本专利技术所述的步骤b）酶解条件为：pH:7.0-7.5，温度：40-45℃，料液比：1:1，时间：5-7h,加酶量:1200-1500u/g；所述的步骤d）中，所述G-25凝胶分离是：将步骤c）获得的酶解液用蒸馏水进行溶解，离心，取上清液，过0.45μm微孔滤膜，取酶解液溶液1.5ml过SephadexG-25柱(90cm×115cm(ID))，用蒸馏水为洗脱液，平衡和洗脱；每管收集3ml，于λ280nm处检测，收集各峰洗脱液；所述的步骤e）中，所述反相高效液相色谱(RT-HPLC)是：即用RT-HPLC进行纯化，色谱条件:1)样品前处理:将样品用0.06%TFA的水溶解到0.6ml，离心（12000-14000RPM，离心10分钟）取上清；2)系统:Agilent1260HPLC；3)柱子:ZorbaxSB-C184.6X2505um；4)进样体积:80-100ul；5)缓冲液、平衡缓冲液:0.06%TFA洗脱缓冲液:0.05%TFA的乙腈；6)梯度:0%–0%B洗脱4分钟，0%–8%B洗脱25分钟，8%-100%B洗脱1分钟，100%-100%B洗脱5分钟；7)流速:1.0ml/min；8）检测:280nm/214nm。一种如上所述鮟鱇鱼骨抗肿瘤十二肽的应用，所述的鮟鱇鱼骨抗肿瘤十二肽作为功能食品，用于前列腺癌患者的辅助功能性食品，对前列腺癌的抑制作用明显。实验方法：一、酶解条件的优化：1、选用中性蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鮟鱇鱼骨抗肿瘤十二肽的制备方法，它选用鮟鱇鱼骨作为原料，其特征在于所述的制备方法包括如下步骤：a）碎料：用高速组织捣碎机将鮟鱇鱼骨进行捣碎处理，制成粉状和微颗粒状的鮟鱇鱼骨粉；b）酶解：选用中性蛋白酶对鮟鱇鱼骨粉进行酶解，制成鮟鱇鱼骨粉酶解液；c）超滤：将鮟鱇鱼骨粉酶解液加入超滤系统，用10KD、5KD、3KD的超滤膜进行超滤，收集>10KD、10‑5KD、5‑3KD和

【技术特征摘要】
1.一种鮟鱇鱼骨抗肿瘤十二肽的制备方法，它选用鮟鱇鱼骨作为原料，其特征在于所述的制备方法包括如下步骤：a）碎料：用高速组织捣碎机将鮟鱇鱼骨进行捣碎处理，制成粉状和微颗粒状的鮟鱇鱼骨粉；b）酶解：选用中性蛋白酶对鮟鱇鱼骨粉进行酶解，制成鮟鱇鱼骨粉酶解液；c）超滤：将鮟鱇鱼骨粉酶解液加入超滤系统，用10KD、5KD、3KD的超滤膜进行超滤，收集>10KD、10-5KD、5-3KD和<3KD分子量的酶解液，进行冷冻干燥，d）鮟鱇鱼酶解液过G-25洗脱液得到5个峰，经体外抗肿瘤实验筛选，峰2和峰3具有最高的抗肿瘤活性的，收集峰2和峰3，冷冻干燥，进一步分离纯化并用高效液相纯度检测；e）经过反相高效液相色谱(RT-HPLC)纯化及氨基酸序列检测：峰3用HPLC检测发现，该分子段只有1个洗脱峰，并进行氨基酸序列检测，其氨基酸序列为Met-Trp-Ile-Phe-His-Asp-Ser-Asp-Lys-Asn-Cys-Arg；制成鮟鱇鱼骨抗肿瘤十二肽产品。2.根据权利要求1所述的鮟鱇鱼骨抗肿瘤十二肽的制备方法，其特征在于：所述的步骤b）酶解条件为：pH:7.0-7.5，温度：40-45℃，料液比：1:1，时间：5-7h,加酶量:1200-150...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄芳芳，
申请(专利权)人：浙江海洋大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33