用于生物样品染色的基于植物的染料、提取方法及其用途技术

本公开内容提供了包含氧化巴西木素的组合物，其可用作荧光染料以用于核酸如DNA和RNA的增强的可视化。本说明书还提供了从树皮原材料中提取氧化巴西木素的简单的、有时间和成本效益的方法。

Plant based dyes, extraction methods and uses for dyeing biological samples

The disclosure provides compositions containing oxidized Brazilian lignin that can be used as fluorescent dyes for visualization of nucleic acids such as DNA and RNA enhancement. This manual also provides a simple, time-consuming and cost-effective method of extracting oxidized Brazilian lignin from bark raw materials.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于生物样品染色的基于植物的染料、提取方法及其用途
本公开内容涉及用于核酸检测的试剂的领域。特别地，本公开内容提供了包含氧化巴西木素(brazilein)的组合物以用于核酸的增强检测。还提供了分离和纯化氧化巴西木素的快速和有成本效益的方法。
技术介绍
染色是用于生物样品的鉴定、检测、可视化、标记、靶向和纯化的重要辅助技术。此外，其也被广泛用于显微术检查以增强显微图像中的对比度。特别地，由于多种原因，例如组织检查、细胞群分类或单个细胞内的细胞器，染色剂和染料常用于化学、生物学和医学中以显示和量化核酸、蛋白质和其他生物材料以突出组织中的结构。染色剂是在与特定靶标接触时表现出可检测响应的化合物。在不存在靶标时，染色剂并不表现出可检测响应。这些特性使染色剂在检测样品中特定靶标的存在或不存在时具有价值。根据化合物、靶标和测定参数，可检测响应可以是定性或定量的。核酸，特别是DNA的检测和量化是非常常见的任务。早期的化学染色剂对于DNA染色有效，但是也使RNA染色。在从天然来源分离时，DNA和RNA通常一起得到。对DNA不具有选择性的染色剂使分离的DNA的量化变得困难，需要在量化之前进行纯化步骤。专业研究需要区分不同类型的核酸，如单链DNA、双链DNA和质粒DNA。通过牺牲安全性，核酸筛选应用使用了目前可获得的有毒和致突变的荧光染色剂。该方法涉及繁琐的安全协议和昂贵的处理实践。特别地，荧光染色剂/染料广泛用于核酸研究以显示和量化琼脂糖凝胶中的DNA/RNA片段。由于低成本和足够的灵密度，溴化乙锭(Ethidiumbromide，EtBr)是数十年来用于核酸筛选的主要染料。然而，与去污和废物处理相关的安全危害和成本可最终使得该染料昂贵且对研究人员和环境不安全。已经开发了多种替代染料如SYBR染料组、凝胶红(Gelred)、凝胶绿(Gelgreen)、Pico绿、二聚花青素(Dimericcyanine)等来代替高毒性的EtBr。一致地，所有这些染料是对检测核酸高度灵敏的合成芳香环结构。尽管其灵敏性较高，但它们表现出一定程度的毒性和致突变性。这些染料反映的安全性要求与高毒性EtBr相当。因此，没有可用于安全地筛选生物样品或核酸的安全荧光染料。化合物氧化巴西木素来源于在亚洲广泛分布的灌木苏木(Caesalpiniasappan)的树皮。此外，通过简单方法从苏木物种提取氧化巴西木素并获得良好产率是十分繁琐和困难的。有报道从云石属(Caesalpinia)物种中提取和分离巴西木素和氧化巴西木素化合物(WO2007066926A1，WO/2007/066926)。所有这些方法作为食品和织物的染色剂解释了氧化巴西木素的提取和表征。然而，未尝试氧化巴西木素在基于凝胶的系统中的核酸染色特性和相关应用。此外，已经使用许多不同的方法和策略来从云石属物种中提取和纯化氧化巴西木素化合物。在题为“MethodforpurifyingBrazilein”的CN102241660(A)中，所涉及的专利技术解释了从巴西苏木(brazilwood)中提取氧化巴西木素的方法。该专利技术使用包含乙醇、乙酸乙酯的溶剂的组合来提取氧化巴西木素。提取方案随后的柱纯化步骤还涉及乙腈、磷酸作为流动相且硅胶作为过滤介质来洗脱氧化巴西木素。该方法还使用制备型高效液相色谱(HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC)来从植物提取物中纯化氧化巴西木索。该方法昂贵且涉及两个纯化方案，导致了冗长和繁琐的程序。题为“Methodforextractingbrazileinfromsappanwood”的专利noCN102219771A中涉及的专利技术要求保护从苏木(sappanwood)提取氧化巴西木素的方法。该方法涉及甲醇作为主要溶剂来处理原材料，然后基于大孔树脂(macroporousresin)的吸附来分离氧化巴西木素。尽管该方法使用甲醇作为纯化氧化巴西木素的溶剂，但使用的浓度、溶剂组合和孵育持续时间并不相同，此外该方法使用了多个其他步骤来提取，包括添加水用于分散、使用大孔树脂用于吸附、使用甲醇梯度进行洗脱、使晶体结晶、洗涤并溶解晶体以及最终在乙醇和乙酸乙酯中重结晶。在题为“amassproductionmethodofbrazileinfromCaesalpiniasappan”的WO2007066926A1中，该专利技术要求保护用于大规模生产的基于醇的氧化巴西木素提取方法。然而，所述提取涉及两阶段结晶，其中醇是纯化氧化巴西木素的唯一溶剂。在题为“RapidandinexpensivemassproductionmethodofbrazileinhavinghighpurityfromCaesalpiniasappan”的韩国专利1020050120665中公开了使用水或醇提取氧化巴西木素的方法，然而其需要重结晶并使用受控的条件和更长的孵育期。专利技术概述在本公开内容的一方面，提供了组合物，其包含：(a)氧化巴西木素((6aS，11bR)-7，11b-二氢-6H-茚并[2，1-c]苯并吡喃-3，6a，9，10-四醇)；(b)至少一种溶剂；以及(c)选自甘油、氯化钠、硫酸镁、二甲基亚砜及其组合的至少一种化合物。在本公开内容的一方面，提供了获得结晶氧化巴西木素((6aS，11bR)-7，11b-二氢-6H-茚并[2，1-c]苯并吡喃-3，6a，9，10-四醇)的方法，所述方法包括：(a)从苏木获得树皮；(b)处理所述树皮以获得粉化树皮；(c)使所述粉化树皮与至少一种溶剂接触以获得第一混合物；(d)使所述第一混合物经受20至90℃的温度直到所述第一混合物的体积减少80至95％，以获得第二混合物；(e)过滤所述第二混合物以获得(i)包含巴西木素和氧化巴西木素的混合物的滤液；和(ii)残留物；以及(f)使所述滤液在22至85℃的温度下与空气或至少一种氧化剂接触以蒸发残余溶剂，以获得结晶形式的氧化巴西木素。在本公开内容的一方面，提供了样品中核酸的检测方法，所述方法包括：(i)获得组合物，所述组合物包含：(a)氧化巴西木素；(b)至少一种溶剂；和(c)选自甘油、氯化钠、硫酸镁和二甲基亚砜的至少一种化合物；以及(ii)使所述组合与所述样品接触。在本公开内容的一方面，提供了组合物，所述组合物包含：(a)氧化巴西木素；(b)至少一种溶剂；和(c)选自甘油、氯化钠、硫酸镁、和二甲基亚砜的至少一种化合物，所述组合物用于样品中核酸的体外或体内检测。在本公开内容的一方面，提供了核酸染色试剂盒，其包含组合物，所述组合物包含：(a)氧化巴西木素((6aS，11bR)-7，11b-二氢-6H-茚并[2，1-c]苯并吡喃-3，6a，9，10-四醇)；(b)至少一种溶剂；以及(c)选自甘油、氯化钠、硫酸镁和二甲基亚砜的至少一种化合物。在本公开内容的一方面，提供了氧化巴西木素，其用于样品中核酸的体外或体内检测。通过参考以下描述和所附权利要求，本主题的这些和其他特征、方面、和优点将更好理解。提供本概述以用于以简化的形式介绍概念的选择。本概述不旨在确定要求保护的主题的关键特征或基本特征，也不旨在限制要求保护的主题的范围。附图简述以下附图构成了本说明书的一部分，并且被包括以进一步本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于检测核酸的组合物，其包含：a.氧化巴西木素((6aS，11bR)‑7，11b‑二氢‑6H‑茚并[2，1‑c]苯并吡喃‑3，6a，9，10‑四醇)；b.至少一种溶剂；以及c.选自甘油、氯化钠、硫酸镁、二甲基亚砜及其组合的至少一种化合物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.06.23 IN 2080/CHE/20151.用于检测核酸的组合物，其包含：a.氧化巴西木素((6aS，11bR)-7，11b-二氢-6H-茚并[2，1-c]苯并吡喃-3，6a，9，10-四醇)；b.至少一种溶剂；以及c.选自甘油、氯化钠、硫酸镁、二甲基亚砜及其组合的至少一种化合物。2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述溶剂选自水、甲醇、乙醇、丙酮及其组合。3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述组合物中所述溶剂的重量百分比为足以溶解氧化巴西木素的量。4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述组合物中氧化巴西木素重量百分比为0.000284至0.0284％。5.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述组合物中氯化钠或硫酸镁重量百分比为0.0001％至0.001％。6.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述组合物中甘油重量百分比为25.2至37.8％。7.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述组合物中二甲基亚砜重量百分比为70至90％。8.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述组合物中氧化巴西木素与氯化钠或硫酸镁的w/w比为1∶0.0035至1∶3.52。9.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述组合物中氧化巴西木素与甘油的w/w比为1∶887至1∶133098。10.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述组合物中氧化巴西木素与二甲基亚砜的w/w比为1∶2464至1∶316901。11.获得结晶氧化巴西木素((6aS，11bR)-7，11b-二氢-6H-茚并[2，1-c]苯并吡喃-3，6a，9，10-四醇)的方法，所述方法包括：a.从苏木(Caesalpiniasappan)获得树皮；b.处理所述树皮以获得粉化树皮；c.使所述粉化树皮与至少一种溶剂接触以获得第一混合物；d.使所述第一混合物经受20至90℃的温度直到所述第一混合物的体积减少80至95％，以获得第二混合物；e.过滤所述第二混合物以获得：i.包含巴西木素和氧化巴西木素的混合物的滤液；和ii残留物；以...

【专利技术属性】
技术研发人员：法蒂玛·贝娜齐尔·贾汉吉尔阿里，亚历克斯·达斯·保罗·拉比达斯，汉达纳哈·苏巴朗·萨维特里，
申请(专利权)人：法蒂玛·贝娜齐尔·贾汉吉尔阿里，
类型：发明
国别省市：印度,IN