大菱鲆生精上皮不同发育时期生殖细胞及体细胞的标记方法及应用技术

本发明专利技术公开了大菱鲆生精上皮不同发育时期生殖细胞及体细胞的标记方法及应用，从大菱鲆精巢cDNA中扩增Amh/Sox9/Gsdf片段，经克隆并择优后提取质粒，以限制性内切酶线性化质粒，回收质粒后制备探针，将样品处理后进行固定、脱水、包埋，切片后进行荧光原位杂交，最后进行细胞核染色，封片后观察拍照。有益效果为：本发明专利技术方法巧妙地将大菱鲆几个关键发育时期的精细胞及Sertoli细胞区分开，标记方法简单易行，精确度较高；大菱鲆生精上皮不同发育时期生殖细胞及体细胞的标记方法可以应用于其他海洋生物的生精上皮细胞区分及标记，为今后鱼类的精子发生及生精上皮内环境研究提供有效方法和科学依据。

【技术实现步骤摘要】
大菱鲆生精上皮不同发育时期生殖细胞及体细胞的标记方法及应用
本专利技术涉及鱼类细胞标记方法领域，尤其是涉及大菱鲆生精上皮不同发育时期生殖细胞及体细胞的标记方法及应用。技术背景精子发生(Spermatogenesis)是指生殖细胞从精原细胞(Spermatogonia)发育为成熟的精子(Spermatozoa)的过程。生精上皮是精子发生的唯一场所，包括生殖细胞(germcell)和体细胞(Sertolicell)。哺乳动物的整个精子发生过程都在Sertoli细胞的孵育下完成。鱼类的精细胞在由Sertoli包裹组成的囊状结构(精小囊SpermatogenicCysts)中发育、成熟。因此，生精上皮的生殖细胞和体细胞的数量和功能直接决定了个体产生精子的质和量。遗憾的是，有关大菱鲆在内的海洋鱼类生精上皮的研究还十分有限，尚缺乏关键发育阶段生殖细胞及体细胞的有效分子标记。给大菱鲆的精子发生研究带来诸多不便，阻碍了对大菱鲆及其他鱼类生殖生物学相关方面的研究。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种大菱鲆生精上皮不同发育时期生殖细胞及体细胞的标记方法，本标记方法可以巧妙地将几个关键发育时期的精细胞及Sertoli细胞区分开，可以捕捉精细胞变态的各个动态时期，填补大菱鲆精细胞变态阶段划分的研究空白，而且操作简单，精确度较高。本专利技术的目的之二在于提供一种大菱鲆生精上皮不同发育时期生殖细胞及体细胞的标记方法的应用，本标记方法可以应用于其他海洋生物的生精上皮细胞区分及标记，为今后鱼类的精子发生及生精上皮内环境研究提供有效依据和科学方法。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：大菱鲆生精上皮不同发育时期生殖细胞及体细胞的标记方法，包括：探针的制备：用于鉴定大菱鲆生精上皮不同发育时期不同细胞类型的基因原位杂交探针如表1所示，从大菱鲆精巢cDNA中扩增Amh/Sox9/Gsdf片段，0.98-1.05％琼脂糖电泳胶回收，亚克隆并连接到PGEM-Teasy载体，转化大肠杆菌感受态，挑选阳性克隆并测序，挑取含选择正确插入方向的单克隆，中量提取质粒；表1.Amh/Sox9/GsdfRNA探针合成引物采用限制性内切酶(NcoI、SpeI)分别线性化质粒，利用PCR产物回收纯化试剂盒纯化线性化的片段并用DEPC处理水溶解，并采用核酸定量仪定量；用T7和SP6RNA转录酶分别合成反义和正义探针，反应各物质及其含量如表2所示；表2.反义探针、正义探针反应的物质及其含量混匀后，于36-37℃孵育100-120分钟；加入2μLDnaseI，36-37℃孵育15-18分钟；加入2μL0.18-0.20mol/LEDTA溶液，EDTA溶液的pH为7.9-8.0；加入3μL4.0-4.2mol/LLiCl溶液及75-80μL预冷的100％酒精，于-20～-25℃放置2-2.5小时；1-4℃、12000-12500rpm离心10-15分钟，70％酒精洗涤2-3次；空气干燥，用20μLDEPC处理水溶解，并定量；用预杂交缓冲液稀释至100ng/μL并于-20～-30℃保存；切片的制备：杂交前实验所用器皿，离心管，试剂均采用0.1％DEPC处理，并高压消毒；用3-4％多聚甲醛溶液固定样品过夜，将多聚甲醛溶解于pH为7.4的磷酸缓冲液中即得多聚甲醛溶液，之后使用梯度甲醇脱水，之后以石蜡包埋，将包埋好的性腺样品进行组织切片，切片厚度为4-5μm，切片用蒸馏水展好之后，36-37℃烘干过夜，将烘干的片子置于1-4℃冰箱保存；荧光原位杂交：a.切片常规脱蜡复水：二甲苯3*5min；100％乙醇2*5min；95％、70％、50％乙醇各5min；4％PFA-PBS固定15min；1×PBST洗涤3*5min；0.2MHCl处理10min；1×PBST洗涤3*5min；蛋白酶K10μg/mL，37℃消化10min；1×PBST洗涤3*5min；b.预杂交：65℃预杂交液中1-2小时；c.杂交：探针用预杂交液稀释至1-2ng/μL，80℃变性10min，每张片子100-200μL杂交液，封口膜分好置于湿盒内65℃过夜，湿盒中含有2*SSCT/50％去离子甲酰胺作为保湿剂；d.杂交后洗涤：65℃温度下，以2×SSCT/50％去离子甲酰胺洗涤2*30min，然后以2×SSCT洗涤15min，以0.2×SSCT洗涤2*30min；室温下以1×PBST洗涤3*5min；e.封闭：室温下以2％封闭液封闭1-2h；f.抗体：室温下以2％封闭液按1:500稀释抗体，稀释2h；g.洗涤：1×PBST洗涤5*10min；1×PBS洗涤5*10min；h.孵育：室温下将荧光放大剂按1:150稀释，孵育1h；i.洗涤：1×PBST洗涤5*10min；j.重复e、f、g操作步骤；k.染细胞核：加入1×PBS稀释的DAPI，避光显色；1×PBST洗涤3*5min终止显色；l.封片后观察拍照。本专利技术中的大菱鲆生精上皮不同发育时期生殖细胞及体细胞的标记方法可以应用于其他海洋生物的生精上皮细胞区分及标记，为其他海洋生物的生精上皮细胞区分及标记提供科学依据与技术参考。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：1)通过不同分子标记(Amh/Sox9/Gsdf)的组合使用，结合双色荧光原位杂交技术，巧妙地将几个关键发育时期的精细胞及Sertoli细胞区分开，可以捕捉精细胞变态的各个动态时期，填补大菱鲆精细胞变态阶段划分的研究空白，标记方法简单易行，精确度较高；2)大菱鲆生精上皮不同发育时期生殖细胞及体细胞的标记方法可以应用于其他海洋生物的生精上皮细胞区分及标记，为今后鱼类的精子发生及生精上皮内环境研究提供有效依据和科学方法。附图说明图1是本专利技术中Amh/Sox9组合在Ⅱ期的双色荧光原位杂交结果示意图；图2是本专利技术中Amh/Sox9组合在Ⅲ期的双色荧光原位杂交结果示意图；图3是本专利技术中Amh/Sox9组合在Ⅳ期的双色荧光原位杂交结果示意图；图4是本专利技术中Amh/Sox9组合在Ⅴ期的双色荧光原位杂交结果示意图；图5是本专利技术中Amh/Sox9组合在Ⅵ期的双色荧光原位杂交结果示意图；图6是本专利技术中Gsdf/Sox9组合在Ⅱ期的双色荧光原位杂交结果示意图；图7是本专利技术中Gsdf/Sox9组合在Ⅳ期的双色荧光原位杂交结果示意图；图8是本专利技术中图7中PartA的局部放大图；图9是本专利技术中图7中PartB的局部放大图；图10是本专利技术中图7中PartC的局部放大图。附图标记：1.Sertoli细胞；2.精原细胞；3.精细胞Ⅶ和精子。具体实施方式下面通过附图和实施例对本专利技术方案作进一步说明：实施例1：大菱鲆生精上皮不同发育时期生殖细胞及体细胞的标记方法，包括：1)探针的制备：从大菱鲆精巢cDNA中扩增Amh/Sox9/Gsdf片段，引物Amh正向序列：TCCACATTCTCACTCTCGAT，反向序列：AGAGTCTCACCATCTCCCTT；Sox9正向序列：GACTTTGGAGCCGTGGACAT，反向序列：TCACGGTCTGGACAGTTGTG；Gsdf正向序列：TGAAGAACCTGCAGCCTCTG，反向序列：TTACTCTTTGCTGGGCTGCTG；以0.98％琼脂糖电泳胶回收，亚克隆并连接到PGEM-Te本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.大菱鲆生精上皮不同发育时期生殖细胞及体细胞的标记方法，包括：探针的制备、切片的制备、荧光原位杂交，其特征在于：所述切片的制备步骤为：杂交前实验所用器皿，离心管，试剂均采用0.1%DEPC处理，并高压消毒；用多聚甲醛溶液固定样品过夜，使用梯度甲醇脱水，之后以石蜡包埋，将包埋好的性腺样品进行组织切片，切片厚度为4‑5µm，切片用DEPC处理水展好，烘干过夜后冷藏。

【技术特征摘要】
1.大菱鲆生精上皮不同发育时期生殖细胞及体细胞的标记方法，包括：探针的制备、切片的制备、荧光原位杂交，其特征在于：所述切片的制备步骤为：杂交前实验所用器皿，离心管，试剂均采用0.1%DEPC处理，并高压消毒；用多聚甲醛溶液固定样品过夜，使用梯度甲醇脱水，之后以石蜡包埋，将包埋好的性腺样品进行组织切片，切片厚度为4-5µm，切片用DEPC处理水展好，烘干过夜后冷藏。2.根据权利要求1所述的大菱鲆生精上皮不同发育时期生殖细胞及体细胞的标记方法，其特征在于：所述切片的制备步骤中多聚甲醛溶液的浓度为3-4%，将多聚甲醛溶解于pH为7.4的磷酸缓冲液中即得。3.根据权利要求1所述的大菱鲆生精上皮不同发育时期生殖细胞及体细胞的标记方法，其特征在于：所述探针的制备步骤为：从大菱鲆精巢cDNA中扩增Amh/Sox9/Gsdf片段，0.98-1.05%琼脂糖电泳胶回收，亚克隆并连接到PGEM-Teasy载体，转化大肠杆菌感受态，挑选阳性克隆并测序，挑取含选择正确插入方向的单克隆，中量提取质粒；采用限制性内切酶NcoI、SpeI分别线性化质粒，利用PCR产物回收纯化试剂盒纯化线性化的片段并用DEPC处理水溶解，并采用核酸定量仪定量；用T7和SP6RNA转录酶分别合成反义和正义探针。4.根据权利要求3所述的大菱鲆生精上皮不同发育时期生殖细胞及体细胞的标记方法，其特征在于：所述探针的制备步骤中，用于鉴定大菱鲆生精上皮不同发育时期不同细胞类型的基因原位杂交探针合成引物为：Amh正向序列：TCCACATTCTCACTCTCGAT，反向序列：AGAGTCTCACCATCTCCCTT，348bp；Sox9正向序列：GACTTTGGAGCCGTGGACAT，反向序列：TCACGGTCTGGACAGTTGTG，666bp；Gsdf正向序列：TGAAGAACCTGCAGCCTCTG，反向序列：TTACTCTTTGCTGGGCTGCTG，553bp。5.根据权利要求3所述的大菱鲆生精上皮不同发育时期生殖细胞及体细胞的标记方法，其特征在于：所述探针的制备步骤中，反义探针合成时反应各物质及其含量为：酶切质粒1µg、10×NTPmix2µL、10×Buffer2µL、RNaseInhibitor1µL、T72µL，以DEPC处理水加至20µL；正义探针合成时反应各物质及其含量为：酶切质粒1µg、10×NTPmix2µL、10×Buffer2µL、RNase...

【专利技术属性】
技术研发人员：柳意樊，刘清华，李军，徐世宏，王彦丰，
申请(专利权)人：浙江海洋大学，中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：浙江,33