【技术实现步骤摘要】
大菱鲆生精上皮不同发育时期生殖细胞及体细胞的标记方法及应用
本专利技术涉及鱼类细胞标记方法领域，尤其是涉及大菱鲆生精上皮不同发育时期生殖细胞及体细胞的标记方法及应用。技术背景精子发生(Spermatogenesis)是指生殖细胞从精原细胞(Spermatogonia)发育为成熟的精子(Spermatozoa)的过程。生精上皮是精子发生的唯一场所，包括生殖细胞(germcell)和体细胞(Sertolicell)。哺乳动物的整个精子发生过程都在Sertoli细胞的孵育下完成。鱼类的精细胞在由Sertoli包裹组成的囊状结构(精小囊SpermatogenicCysts)中发育、成熟。因此，生精上皮的生殖细胞和体细胞的数量和功能直接决定了个体产生精子的质和量。遗憾的是，有关大菱鲆在内的海洋鱼类生精上皮的研究还十分有限，尚缺乏关键发育阶段生殖细胞及体细胞的有效分子标记。给大菱鲆的精子发生研究带来诸多不便，阻碍了对大菱鲆及其他鱼类生殖生物学相关方面的研究。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种大菱鲆生精上皮不同发育时期生殖细胞及体细胞的标记方法，本标记方法可以巧妙...
【技术保护点】
1.大菱鲆生精上皮不同发育时期生殖细胞及体细胞的标记方法，包括：探针的制备、切片的制备、荧光原位杂交，其特征在于：所述切片的制备步骤为：杂交前实验所用器皿，离心管，试剂均采用0.1%DEPC处理，并高压消毒；用多聚甲醛溶液固定样品过夜，使用梯度甲醇脱水，之后以石蜡包埋，将包埋好的性腺样品进行组织切片，切片厚度为4‑5µm，切片用DEPC处理水展好，烘干过夜后冷藏。
【技术特征摘要】
1.大菱鲆生精上皮不同发育时期生殖细胞及体细胞的标记方法，包括：探针的制备、切片的制备、荧光原位杂交，其特征在于：所述切片的制备步骤为：杂交前实验所用器皿，离心管，试剂均采用0.1%DEPC处理，并高压消毒；用多聚甲醛溶液固定样品过夜，使用梯度甲醇脱水，之后以石蜡包埋，将包埋好的性腺样品进行组织切片，切片厚度为4-5µm，切片用DEPC处理水展好，烘干过夜后冷藏。2.根据权利要求1所述的大菱鲆生精上皮不同发育时期生殖细胞及体细胞的标记方法，其特征在于：所述切片的制备步骤中多聚甲醛溶液的浓度为3-4%，将多聚甲醛溶解于pH为7.4的磷酸缓冲液中即得。3.根据权利要求1所述的大菱鲆生精上皮不同发育时期生殖细胞及体细胞的标记方法，其特征在于：所述探针的制备步骤为：从大菱鲆精巢cDNA中扩增Amh/Sox9/Gsdf片段，0.98-1.05%琼脂糖电泳胶回收，亚克隆并连接到PGEM-Teasy载体，转化大肠杆菌感受态，挑选阳性克隆并测序，挑取含选择正确插入方向的单克隆，中量提取质粒；采用限制性内切酶NcoI、SpeI分别线性化质粒，利用PCR产物回收纯化试剂盒纯化线性化的片段并用DEPC处理水溶解，并采用核酸定量仪定量；用T7和SP6RNA转录酶分别合成反义和正义探针。4.根据权利要求3所述的大菱鲆生精上皮不同发育时期生殖细胞及体细胞的标记方法，其特征在于：所述探针的制备步骤中，用于鉴定大菱鲆生精上皮不同发育时期不同细胞类型的基因原位杂交探针合成引物为：Amh正向序列：TCCACATTCTCACTCTCGAT，反向序列：AGAGTCTCACCATCTCCCTT，348bp；Sox9正向序列：GACTTTGGAGCCGTGGACAT，反向序列：TCACGGTCTGGACAGTTGTG，666bp；Gsdf正向序列：TGAAGAACCTGCAGCCTCTG，反向序列：TTACTCTTTGCTGGGCTGCTG，553bp。5.根据权利要求3所述的大菱鲆生精上皮不同发育时期生殖细胞及体细胞的标记方法，其特征在于：所述探针的制备步骤中，反义探针合成时反应各物质及其含量为：酶切质粒1µg、10×NTPmix2µL、10×Buffer2µL、RNaseInhibitor1µL、T72µL，以DEPC处理水加至20µL；正义探针合成时反应各物质及其含量为：酶切质粒1µg、10×NTPmix2µL、10×Buffer2µL、RNase...
【专利技术属性】
技术研发人员：柳意樊，刘清华，李军，徐世宏，王彦丰，
申请(专利权)人：浙江海洋大学，中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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