本发明专利技术提供一种RT‑qPCR检测树鼩SLC22A12/URAT1基因转录水平的方法。以树鼩新鲜肾脏组织提取总RNA，按常规逆转录合成得树鼩肾脏组织cDNA第一链为模板，利用PCR引物组合进行实时荧光定量PCR扩增，获得SLC22A12/URAT1基因片段及内参基因GAPDH片段的Ct值、溶解峰及扩增效率；通过处理得出均一化后的SLC22A12/URAT1基因倍数表达的ΔΔC(t)值而获得SLC22A12/URAT1基因转录水平相对表达值。为研究树鼩尿酸盐阴离子转运体1功能以及相关药物对其影响提供了有效途径。本发明专利技术适用于实时定量PCR检测，其灵敏性高、特异性强、操作简单，可重复性高。
【技术实现步骤摘要】
RT-qPCR检测树鼩SLC22A12/URAT1基因转录水平的方法
本专利技术涉及一种检测方法，尤其是一种用实时荧光定量RT-qPCR法检测树鼩尿酸盐阴离子转运体1（SLC22A12/URAT1）转录水平的方法，属于分子生物
技术介绍
尿酸盐阴离子转运体1（urateaniontransporter1，URAT1）是人肾小管重吸收尿酸的主要转运蛋白,是第一个被发现的与肾脏尿酸盐转运的相关蛋白，主要存在于肾小管上皮细胞刷状缘膜上，属于有机阴离子转运蛋白(OAT)家族，编码基因为SLC22A12，通过介导尿酸从管腔内利用重吸收作用(管腔两侧的浓度梯度和化学梯度)转运到肾小管上皮细胞，具有强大的尿酸重吸收能力。机体内,尿酸经肾小球滤过、肾小管重吸收、肾小管再分泌及分泌后重吸收4个过程排泄出体外,而原尿中90%的尿酸被近曲小管S1段的URAT1重吸收进入上皮细胞,继而重新进入血液循环，UＲAT1对近曲小管重吸收起到了关键性的调节作用，抑制URAT1将大大减少尿酸重吸收而促进尿酸排泄。近年来，随着人民生活水平的提高，饮食结构和生活习惯的改变，高尿酸血症（hyperuricemia，HUA）的患病率逐年增高，流行病学研究资料表明高尿酸血症和原发性痛风的发病呈上升趋势，在中国，已经有1.2亿的HUA人群，大约占总人口的10%，中老年及绝经后的妇女为高发人群，近年来发病年龄也呈年轻化的趋势。高尿酸血症与肥胖、高血压、高脂血症、冠状动脉粥样硬化性心脏病、胰岛素抵抗的发生密切相关，已成为识别代谢综合征的早期标志，治疗和控制高尿酸血症已成为代谢性疾病治疗的重要组成部分。无论是药物的筛选,还是致病机制的研究,都需要选择一种科学、合理的动物模型来开展高尿酸血症致病机理的研究及开发相关降血尿酸的药物。树鼩（Tupaiabelangeri,treeshrews)，是一种非啮齿类哺乳动物，其分类地位介于灵长目与食虫目之间。树鼩具有体型小，易饲养和操作，管理方便，廉价经济，且其进化程度高，新陈代谢和大体解剖比犬、大小鼠等动物与人更为接近，解剖结构也更近似于人，因此其作为较理想的实验动物在医学与生物学的研究中广泛应用。利用亲缘关系与人类接近的实验动物——树鼩来开展高尿酸血症致病机理的研究及开发相关降血尿酸的药物，需要建立一种树鼩尿酸盐阴离子转运体1，即SLC22A12/URAT1mRNA表达的相对定量方法，以研究药物作用树鼩体内SLC22A12/URAT1基因的转录水平变化，进而为研究URAT1功能及其对机体血清尿酸的影响因素打下基础。因此,建立RT-qPCR检测树鼩尿酸盐阴离子转运体1（SLC22A12/URAT1）基因转录水平的方法，可对于开展利用动物模型开展的HUA发病机制研究及新药筛选具有重要意义。实时荧光定量PCR的基因扩增法已被广泛应用于基因转录水平的定量研究。该方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、自动化程度高、全封闭反应等优点。目前国内外还未见利用树鼩进行SLC22A12/URAT1转录水平定量检测方法的研究。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用实时荧光定量RT-qPCR法检测树鼩尿酸盐阴离子转运体1（SLC22A12/URAT1）转录水平的方法，以在转录水平上对SLC22A12/URAT1基因进行定量检测。为实现上述目的，本专利技术以样品总RNA反转录成的cDNA为模板，利用PCR引物组合进行实时荧光定量PCR扩增，根据反应体系中荧光的变化情况定量分析SLC22A12/URAT1转录水平。本专利技术的具体方案是：一种RT-qPCR检测树鼩SLC22A12/URAT1基因转录水平的方法，其特征在于包括下列步骤：（1）设计下列引物：树鼩SLC22A12/URAT1表达水平的特异性上、下游引物为：SLC22A12/URAT1F：5＇-CTACGACCACGGCACTTTCA-3＇SLC22A12/URAT1R：5＇-AAGGTAACTCCAGGTCAGCAC-3＇作为内参基因的树鼩GAPDH基因的特异性上、下游引物为：GAPDHF：5＇-AGCCCCATCACCATCTTCC-3＇GAPDHR：5＇-AATGAGCCCCAGCCTTCTC-3＇；（2）以树鼩新鲜肾脏组织提取的总RNA为模板，按常规逆转录合成得树鼩肾脏组织cDNA第一链；（3）以步骤（2）的树鼩肾脏组织cDNA第一链为cDNA模板，以步骤（1）中的SLC22A12/URAT1F和SLC22A12/URAT1R上、下游引物以及GAPDHF和GAPDHR上、下游引物为特异性引物，分别在下列PCR扩增体系及反应条件下进行实时荧光定量PCR扩增，扩增结束后根据荧光信号的数据，分别获得SLC22A12/URAT1基因片段及内参基因GAPDH片段的Ct值及溶解峰，目的基因片段及内参基因片段的溶解峰单一，说明PCR扩增的特异性好；所述PCR扩增体系及反应条件如下：PCR扩增体系即25μL体系：SYBRPremixExTaqII酶12.5μL，cDNA模板1μL，SLC22A12/URAT1F和SLC22A12/URAT1R上、下游引物各1μL，去离子水9.5μL；SYBRPremixExTaqII酶12.5μL，cDNA模板1μL，GAPDHF和GAPDHR上、下游引物各1μL，去离子水9.5μL；反应条件：94℃预变性30s，94℃变性5s、60℃退火30s、40个循环，59℃到94℃每5s采集一次荧光信号；（4）将步骤（2）的树鼩肾脏组织cDNA第一链稀释为100、10-1、10-2、10-3、10-4倍浓度作为cDNA模板，以步骤（1）中的SLC22A12/URAT1F和SLC22A12/URAT1R以及GAPDHF和GAPDHR为特异性引物，分别按步骤（3）的PCR扩增体系及反应条件进行荧光定量PCR扩增，反应结束后根据荧光信号的数据，获得Ct值，通过qPCR仪器自带CFXManager软件建立SLC22A12/URAT1基因及内参基因GAPDH的溶解曲线及标准曲线，得到SLC22A12/URAT1基因片段及内参基因GAPDH片段的扩增效率、斜率及R2值；当SLC22A12/URAT1基因片段及内参基因GAPDH片段扩增效率分别在80%至120%之间，同时R2接近1时，说明结果可信度较高，符合荧光定量PCR要求，可进一步进行待检样品检测；（5）在步骤（3）的PCR扩增体系及反应条件下，以步骤（2）的树鼩肾脏组织cDNA第一链作为待测样品cDNA模板，进行实时荧光定量PCR扩增，得到对应的Ct值，将该Ct值以及步骤（4）得到的SLC22A12/URAT1目的基因及内参基因GAPDH的扩增效率，通过qPCR仪器自带CFXManager软件处理，得出均一化后的SLC22A12/URAT1基因倍数表达的ΔΔC(t)值，从而获得SLC22A12/URAT1基因转录水平相对表达值。所述步骤3）获得的PCR扩增产物SLC22A12/URAT1基因片段及内参基因GAPDH片段分别经过下列验证：1）通过商业生物公司测序分别得到：所扩增的树鼩SLC22A12/URAT1基因片段核苷酸序列为：AAGGCTGGGACTGGTGTGTGACTCTCGGGCCCTGA本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种RT‑qPCR检测树鼩SLC22A12/URAT1基因转录水平的方法，其特征在于包括下列步骤：（1）设计下列引物：树鼩SLC22A12/URAT1表达水平的特异性上、下游引物为：SLC22A12/ URAT1 F：5＇‑ CTACGACCACGGCACTTTCA‑3＇SLC22A12/ URAT1 R：5＇‑ AAGGTAACTCCAGGTCAGCAC‑3＇作为内参基因的树鼩GAPDH基因的特异性上、下游引物为： GAPDH F：5＇‑AGCCCCATCACCATCTTCC‑3＇GAPDH R：5＇‑ AATGAGCCCCAGCCTTCTC ‑3＇；（2）以树鼩新鲜肾脏组织提取的总RNA为模板，按常规逆转录合成得树鼩肾脏组织cDNA第一链；（3）以步骤（2）的树鼩肾脏组织cDNA第一链为cDNA模板，以步骤（1）中的SLC22A12/URAT1 F和SLC22A12/URAT1 R上、下游引物以及GAPDH F和GAPDH R上、下游引物为特异性引物，分别在下列PCR扩增体系及反应条件下进行实时荧光定量PCR扩增，扩增结束后根据荧光信号的数据，分别获得SLC22A12/URAT1基因片段及内参基因GAPDH片段的Ct值及溶解峰；所述PCR扩增体系及反应条件如下：PCR扩增体系即25μL体系：SYBR Premix Ex Taq II 酶 12.5μL，cDNA模板1μL，SLC22A12/URAT1 F和SLC22A12/URAT1 R上、下游引物各1μL，去离子水9.5μL；SYBR Premix Ex Taq II 酶 12.5μL，cDNA模板1μL，GAPDH F和GAPDH R上、下游引物各1μL，去离子水9.5μL；反应条件：94℃预变性30s，94℃变性5s、60℃退火30s、40个循环，59℃到94℃每5s采集一次荧光信号；（4）将步骤（2）的树鼩肾脏组织cDNA第一链稀释为100、10‑1、10‑2、10‑3、10‑4倍浓度作为cDNA模板，以步骤（1）中的SLC22A12/URAT1 F和SLC22A12/URAT1 R以及GAPDH F和GAPDH R为特异性引物，分别按步骤（3）的PCR扩增体系及反应条件进行荧光定量PCR扩增，反应结束后根据荧光信号的数据，获得Ct值，通过qPCR仪器自带CFXManager 软件建立SLC22A12/URAT1基因及内参基因GAPDH的标准曲线，得到SLC22A12/URAT1基因片段及内参基因GAPDH片段的扩增效率、斜率及R2 值；（5）在步骤（3）的PCR扩增体系及反应条件下，以步骤（2）的树鼩肾脏组织cDNA第一链作为待测样品cDNA模板，进行实时荧光定量PCR扩增，得到对应的Ct值，将该Ct值以及步骤（4）得到的SLC22A12/URAT1目的基因及内参基因GAPDH的扩增效率，通过qPCR仪器自带CFX Manager 软件处理，得出均一化后的SLC22A12/URAT1基因倍数表达的ΔΔC(t)值，从而获得SLC22A12/URAT1基因转录水平相对表达值。...
【技术特征摘要】
1.一种RT-qPCR检测树鼩SLC22A12/URAT1基因转录水平的方法，其特征在于包括下列步骤：（1）设计下列引物：树鼩SLC22A12/URAT1表达水平的特异性上、下游引物为：SLC22A12/URAT1F：5＇-CTACGACCACGGCACTTTCA-3＇SLC22A12/URAT1R：5＇-AAGGTAACTCCAGGTCAGCAC-3＇作为内参基因的树鼩GAPDH基因的特异性上、下游引物为：GAPDHF：5＇-AGCCCCATCACCATCTTCC-3＇GAPDHR：5＇-AATGAGCCCCAGCCTTCTC-3＇；（2）以树鼩新鲜肾脏组织提取的总RNA为模板，按常规逆转录合成得树鼩肾脏组织cDNA第一链；（3）以步骤（2）的树鼩肾脏组织cDNA第一链为cDNA模板，以步骤（1）中的SLC22A12/URAT1F和SLC22A12/URAT1R上、下游引物以及GAPDHF和GAPDHR上、下游引物为特异性引物，分别在下列PCR扩增体系及反应条件下进行实时荧光定量PCR扩增，扩增结束后根据荧光信号的数据，分别获得SLC22A12/URAT1基因片段及内参基因GAPDH片段的Ct值及溶解峰；所述PCR扩增体系及反应条件如下：PCR扩增体系即25μL体系：SYBRPremixExTaqII酶12.5μL，cDNA模板1μL，SLC22A12/URAT1F和SLC22A12/URAT1R上、下游引物各1μL，去离子水9.5μL；SYBRPremixExTaqII酶12.5μL，cDNA模板1μL，GAPDHF和GAPDHR上、下游引物各1μL，去离子水9.5μL；反应条件：94℃预变性30s，94℃变性5s、60℃退火30s、40个循环，59℃到94℃每5s采集一次荧光信号；（4）将步骤（2）的树鼩肾脏组织cDNA第一链稀释为100、10-1、10-2、10-3、10-4倍浓度作为cDNA模板，以步骤（1）中的SLC22A12/URAT1F和SLC22A12/URAT1R以及GAPDHF和GAPDHR为特异性引物，分别按步骤（3）的PCR扩增体系及反应条件进行荧光定量PCR扩增，反应结束后根据荧光信号的数据，获得Ct值，通过qPCR仪器自带CFXManager软件建立SLC22A12/URAT1基因及...
【专利技术属性】
技术研发人员：唐东红，王陈芸，叶尤松，李哲丽，马开利，鲁帅尧，肖涵，邱炳玲，陈倩，杨浩，杨忠，
申请(专利权)人：中国医学科学院医学生物学研究所，
类型：发明
国别省市：云南,53
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