一种表达甲酰胺酶与亚磷酸脱氢酶融合蛋白的重组大肠杆菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种表达甲酰胺酶与亚磷酸脱氢酶融合蛋白的大肠杆菌及其构建方法与应用。本发明专利技术以大肠杆菌DH5α工程菌为宿主，将克隆得到的甲酰胺酶基因和亚磷酸脱氢酶基因扩增成为融合基因，再连接在载体的多克隆位点上，并将得到的重组质粒转化入DH5α，提取质粒并转入表达菌株中，经诱导培养得到重组大肠杆菌。该重组大肠杆菌表达产生甲酰胺酶与氧化亚磷酸脱氢酶融合蛋白，该融合蛋白能同时分解甲酰胺生成NH4+和氧化亚磷酸盐磷酸盐成为磷酸盐，为重组大肠杆菌工程菌提供生长繁殖所需要的氮源和磷源，而其他微生物由于缺乏拥有这两条途径，无法在含有甲酰胺和亚磷酸盐的MOPS培养基中生长繁殖，解决了大肠杆菌在工业发酵中染菌问题。

Recombinant Escherichia coli expressing fusion protein of formamidase and phosphite dehydrogenase and construction method and application thereof

The invention discloses an Escherichia coli expressing a fusion protein of formamidase and phosphite dehydrogenase, and its construction method and application. The present invention uses Escherichia coli DH5 alpha as the host, amplifying the cloned methamidase gene and subphosphate dehydrogenase gene into the fusion gene, then connecting it on the polyclonal site of the carrier, and transforming the obtained recombinant plasmid into DH5 a, extracting the plasmid and transferring the plasmid into the expressed strain. The recombinant Escherichia coli is induced and cultured to get the recombinant large intestine. Bacillus. The recombinant Escherichia coli expresses formamidase and oxidative subphosphate dehydrogenase fusion protein, which can simultaneously decompose formamide to NH4+ and oxidized phosphite phosphate to become phosphate, providing the nitrogen source and phosphorus source for the recombinant Escherichia coli engineering bacteria for growth and reproduction, and other microorganisms due to lack of possession. These two pathways can not grow and propagate in MOPS medium containing formamide and phosphite, and solve the problem of Escherichia coli contamination in industrial fermentation.

【技术实现步骤摘要】
一种表达甲酰胺酶与亚磷酸脱氢酶融合蛋白的重组大肠杆菌及其构建方法与应用
本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及一种表达甲酰胺酶与亚磷酸脱氢酶融合蛋白的重组大肠杆菌及其构建方法与应用。
技术介绍
大肠杆菌是目前使用最广泛的宿主之一，这是因为大肠杆菌基因组被研究的透彻，并且繁殖快、发酵周期短。所以，大肠杆菌在工业发酵行业中受到企业家密切关注和重视。但是，在大肠杆菌发酵过程中，染菌问题依然企业最关注的问题。一旦染菌，不但造成经济损失、浪费原理和时间，还会给废料处理增加难度。所以，要是能找到一种方法，能解决大肠杆菌在发酵过程中被杂菌污染的问题，在促进企业的利润增长，还是对于社会的发展，将是非常有意义的。目前关于发酵染菌的研究多集中在发酵染菌的来源(途径)及相关的菌形、不同发酵阶段染菌对发酵的影响及防治措施、从设备角度的分析和防治等方面。为了降低染菌，企业一般是从提高设备要求和操作员的技术水平入手。但是，复杂的周边环境，和发酵仪器隐秘部位，都使得在发酵工程时常染菌。针对以上的大肠杆菌发酵过程染菌现象，研究从营养物质底物谱的摄取进行研究，对大肠杆菌的营养代谢途径进行改造，使改造后的大肠杆菌工程菌能表达甲酰胺酶与亚磷酸脱氢酶融合蛋白，该融合蛋白能分解甲酰胺产生氨作为氮源和分解氧化亚磷酸盐成为磷酸盐作为磷源，改变其氮源和磷源的来源途径，使其在特定的MOPS培养基中能正常生长，而不同时具有这两条代谢途径的杂菌微生物就会由于缺乏氮源或磷源营养物质的来源而被“饿死”。一方面，重组菌能表达融合蛋白利用甲酰胺和亚磷酸盐；另一方面，重组菌还能表达外源基因，包括抗体和其他有价值的酶制剂。同时，为验证该构建的工程菌合成外源基因的能力，还把绿色荧光蛋白基因转化入该工程菌进行共表达。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供了一种表达甲酰胺酶与亚磷酸脱氢酶融合蛋白的重组大肠杆菌，具体为一种能高效表达甲酰胺酶与氧化亚磷酸脱氢酶融合蛋白的重组大肠杆菌。该重组大肠杆菌表达甲酰胺酶与氧化亚磷酸脱氢酶融合蛋白基因for-Linker-ptx，产生甲酰胺酶与氧化亚磷酸脱氢酶融合蛋白，该融合蛋白能同时分解甲酰胺生成NH4+和氧化亚磷酸盐磷酸盐成为磷酸盐，为重组大肠杆菌工程菌提供生长繁殖所需要的氮源和磷源，而其他不同时具有这两条代谢途径的微生物则会由于缺乏氮源和磷源的代谢途径而被“饿死”。本专利技术的目的还在于提供所述的一种表达甲酰胺酶与亚磷酸脱氢酶融合蛋白的重组大肠杆菌的构建方法。该构建方法以大肠杆菌DH5α工程菌为宿主，利用重叠PCR技术，将克隆自类芽孢杆菌Paenibacilluspasadenensis.CS0611的含Linker序列的甲酰胺酶基因for-Linker和肺炎克雷伯菌Klebsiellapneumonia.OU7的亚磷酸脱氢酶基因ptx扩增成为融合基因for-Linker-ptx，再连接在载体pGEX-2T的多克隆位点上，并将得到的重组质粒pGEX-2T-for-Linker-ptx转化入DH5α；验证成功后，提取pGEX-2T-for-Linker-ptx质粒，转化入大肠杆菌表达菌株E.coliBL21(DE3)中，得到重组表达菌株BL21(DE3)(pGEX-2T-for-Linker-ptx)，并继续在含有甲酰胺和亚磷酸盐的MOPS培养基中诱导培养重组大肠杆菌。利用Linker把扩增得到的甲酰胺酶基因for和亚磷酸脱氢酶基因ptx连接在一起，使两个酶基因融合表达，发挥其酶催化功能，实现重组大肠杆菌在含有甲酰胺和亚磷酸盐的MOPS培养基中正常生长繁殖并使其功能得到表达。本专利技术的目的还在于提供所述的一种表达甲酰胺酶与亚磷酸脱氢酶融合蛋白的重组大肠杆菌的应用。本专利技术的目的通过如下技术方案实现。一种表达甲酰胺酶与亚磷酸脱氢酶融合蛋白的大肠杆菌的构建方法，包括如下步骤：(1)设计引物，PCR扩增含Linker序列的甲酰胺酶基因(3'端含Linker序列)上游引物下划线斜体为BamHI酶切点；下游引物A2(5'-CGACCCACCACCGCCCGAGCCACCGCCACCTCGCGCCGCGCCTCCCTTCGC-3')，下划线为Linker序列；以类芽孢杆菌Paenibacilluspasadenensis.CS0611的基因组为模板，克隆出1041bp的含Linker序列的甲酰胺酶基因序列for-Linker；将克隆得到的基因序列for-Linker连接到载体pMD-19TSimple上，再将重组载体转化到大肠杆菌DH5α，得到含有重组载体pMD-19TSimple-for-Linker的重组大肠杆菌DH5α(pMD-19TSimple-for-Linker)；然后，以A1和B1(5'-TATAACGAGTTTCGGCAGCATCGACCCACCACCGCCCGAGCCA-3')扩增for-Linker片段；(2)设计引物，PCR扩增亚磷酸脱氢酶基因上游引物B2(5'-TGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGATGCTGCCGAAACTCGTTATA-3')，下划线为Linker的部分DNA；下游引物B3下划线斜体为EcoRⅠ酶切点；以肺炎克雷伯菌Klebsiellapneumonia.OU7的基因组为模板，克隆出1008bp的亚磷酸脱氢酶基因序列ptx，得到ptx片段；(3)重叠PCR扩增得到融合基因for-Linker-ptx以步骤(1)、步骤(2)扩增得到的for-Linker片段和ptx片段为模板，以A1和引物B3分别为上游、下游引物，扩增得到甲酰胺酶与亚磷酸脱氢酶融合基因for-Linker-ptx；利用BamHI和EcoRⅠ对融合基因for-Linker-ptx进行双酶切，连接入同样酶切后的pGEX-2T表达质粒，转化入DH5α，得到阳性克隆子DH5α(pGEX-for-Linker-ptx)；(4)转化表达重组菌株从重组大肠杆菌DH5α(pGEX-for-Linker-ptx)中提取重组质粒pGEX-for-Linker-ptx，并将重组质粒pGEX-for-Linker-ptx转化入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中，得到重组表达菌株BL21(DE3)(pGEX-for-Linker-ptx)；(5)诱导培养重组大肠杆菌将得到的重组表达菌株BL21(DE3)(pGEX-for-Linker-ptx)接种到LB培养基中，进行诱导培养后，收集菌体并加入到含有甲酰胺和亚磷酸盐的MOPS培养基中，继续培养得到重组大肠杆菌。进一步地，步骤(1)中，所述类芽孢杆菌Paenibacilluspasadenensis.CS0611的含Linker序列的甲酰胺酶基因序列如序列表SEQ1所示，片段长度为1041bp，含Linker序列(GGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCG)，编码347个氨基酸。进一步地，步骤(1)中，所述类芽孢杆菌Paenibacilluspasadenensis.CS0611于2014年10月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为：中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCCNO：M2014458。进一步地，步骤(1)中，所述PCR扩增的条件为：94℃反应5min；于9本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种表达甲酰胺酶与亚磷酸脱氢酶融合蛋白的大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)设计引物，PCR扩增含Linker序列的甲酰胺酶基因上游引物A1(5'‑CGCGGATCCGATGAACGGACTGGGCGGCTTGAAC‑3')，下划线斜体为BamH I酶切点；下游引物A2(5'‑CGACCCACCACCGCCCGAGCCACCGCCACCTCGCGCCGCGCCTCCCTTCGC‑3')，下划线为Linker序列；以类芽孢杆菌Paenibacillus pasadenensis.CS0611的基因组为模板，克隆出1041bp的含Linker序列的甲酰胺酶基因序列for‑Linker；将克隆得到的基因序列for‑Linker连接到载体pMD‑19T Simple上，再将重组载体转化到大肠杆菌DH5α，得到含有重组载体pMD‑19T Simple‑for的重组大肠杆菌DH5α(pMD‑19T Simple‑for)；然后，以A1和B1(5'‑TATAACGAGTTTCGGCAGCATCGACCCACCACCGCCCGAGCCA‑3')扩增for‑Linker片段；(2)设计引物，PCR扩增亚磷酸脱氢酶基因上游引物B2(5'‑TGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGATGCTGCCGAAACTCGTTATA‑3')，下划线为Linker的部分DNA；下游引物B3(5'‑CCGGAATTCCGACATGCGGCAGGCTCGGCCTTGGGC‑3')，下划线斜体为EcoRⅠ酶切点；以肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumonia.OU7的基因组为模板，克隆出1008bp的亚磷酸脱氢酶基因序列ptx，得到ptx片段；(3)重叠PCR扩增得到融合基因以步骤(1)、步骤(2)扩增得到的for‑Linker片段和ptx片段为模板，以A1和引物B3分别为上游、下游引物，扩增得到甲酰胺酶与亚磷酸脱氢酶融合基因for‑Linker‑ptx；利用BamHI和EcoRⅠ对融合基因for‑Linker‑ptx进行双酶切，连接入利用相同酶进行酶切的pGEX‑2T表达质粒，转化入DH5α，得到阳性克隆子DH5α(pGEX‑for‑Linker‑ptx)；(4)转化表达重组菌株从重组大肠杆菌DH5α(pGEX‑for‑Linker‑ptx)中提取重组质粒pGEX‑for‑Linker‑ptx，并将重组质粒pGEX‑for‑Linker‑ptx转化入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中，得到重组表达菌株BL21(DE3)(pGEX‑for‑Linker‑ptx)；(5)诱导培养重组大肠杆菌将得到的重组表达菌株BL21(DE3)(pGEX‑for‑Linker‑ptx)接种到LB培养基中，进行诱导培养后，收集菌体并加入到含有甲酰胺和亚磷酸盐的MOPS培养基中，继续培养得到重组大肠杆菌。...

【技术特征摘要】
1.一种表达甲酰胺酶与亚磷酸脱氢酶融合蛋白的大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)设计引物，PCR扩增含Linker序列的甲酰胺酶基因上游引物A1(5'-CGCGGATCCGATGAACGGACTGGGCGGCTTGAAC-3')，下划线斜体为BamHI酶切点；下游引物A2(5'-CGACCCACCACCGCCCGAGCCACCGCCACCTCGCGCCGCGCCTCCCTTCGC-3')，下划线为Linker序列；以类芽孢杆菌Paenibacilluspasadenensis.CS0611的基因组为模板，克隆出1041bp的含Linker序列的甲酰胺酶基因序列for-Linker；将克隆得到的基因序列for-Linker连接到载体pMD-19TSimple上，再将重组载体转化到大肠杆菌DH5α，得到含有重组载体pMD-19TSimple-for的重组大肠杆菌DH5α(pMD-19TSimple-for)；然后，以A1和B1(5'-TATAACGAGTTTCGGCAGCATCGACCCACCACCGCCCGAGCCA-3')扩增for-Linker片段；(2)设计引物，PCR扩增亚磷酸脱氢酶基因上游引物B2(5'-TGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGATGCTGCCGAAACTCGTTATA-3')，下划线为Linker的部分DNA；下游引物B3(5'-CCGGAATTCCGACATGCGGCAGGCTCGGCCTTGGGC-3')，下划线斜体为EcoRⅠ酶切点；以肺炎克雷伯菌Klebsiellapneumonia.OU7的基因组为模板，克隆出1008bp的亚磷酸脱氢酶基因序列ptx，得到ptx片段；(3)重叠PCR扩增得到融合基因以步骤(1)、步骤(2)扩增得到的for-Linker片段和ptx片段为模板，以A1和引物B3分别为上游、下游引物，扩增得到甲酰胺酶与亚磷酸脱氢酶融合基因for-Linker-ptx；利用BamHI和EcoRⅠ对融合基因for-Linker-ptx进行双酶切，连接入利用相同酶进行酶切的pGEX-2T表达质粒，转化入DH5α，得到阳性克隆子DH5α(pGEX-for-Linker-ptx)；(4)转化表达重组菌株从重组大肠杆菌DH5α(pGEX-for-Linker-ptx)中提取重组质粒pGEX-for-Linker-ptx，并将重组质粒pGEX-for-Linker-ptx转化入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中，得到重组表达菌株BL21(DE3)(pGEX-for-Linker-ptx)；(5)诱导培养重组大肠杆菌将得到的重组表达菌株BL21(DE3)(pGEX-for-Linker-ptx)接种到LB培养基中，进行诱导培养后，收集菌体并加入到含有甲酰胺和亚磷酸盐的MOPS培养基中，继续培养得到重组大肠杆菌。2.根据权利要求1所述的一种表达甲酰胺酶与亚磷酸脱氢酶融合蛋白的大肠杆菌的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述类芽孢杆菌Paenibacilluspasadenensis.CS0611的含Linker序列的甲酰胺酶基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：娄文勇，区晓阳，宗敏华，高嘉心，彭飞，徐培，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东,44