重组细胞、重组细胞的制造方法以及1,4-丁二醇的生产方法技术

本发明专利技术的课题在于，提供一种利用重组细胞的1,4‑丁二醇的生产技术。一种重组细胞，其为专性厌氧性且具有生成乙酸的能力，其中，具有编码选自由琥珀酸半醛脱氢酶、琥珀酰CoA合成酶、CoA依赖型琥珀酸半醛脱氢酶、4‑羟基丁酸脱氢酶、4‑羟基丁酸CoA转移酶、4‑羟基丁酸CoA还原酶、4‑羟基丁基醛脱氢酶、及醇脱氢酶中的至少一种酶的基因，该基因表达，可以生产1,4‑丁二醇。

Method for manufacturing recombinant cell, recombinant cell and production method of 1,4- butanediol

The subject of the invention is to provide a production technology of 1,4 butanediol using recombinant cells. A recombinant cell, which is specific and anaerobic and has the ability to produce acetic acid, including free succinic acid semi aldehyde dehydrogenase, succinyl CoA synthetase, CoA dependent succinic acid semi aldehyde dehydrogenase, 4 hydroxy butyrate dehydrogenase, 4 hydroxy butyric acid CoA transferase, 4 hydroxybutyrate CoA reductase, 4 hydroxybutyrate. A gene of at least one enzyme in aldehyde dehydrogenase and alcohol dehydrogenase, which can produce 1,4 butanediol.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】重组细胞、重组细胞的制造方法以及1,4-丁二醇的生产方法
本专利技术涉及一种重组细胞、重组细胞的制造方法以及1,4-丁二醇的生产方法。
技术介绍
1,4-丁二醇(1,4-Butanediol)作为合成橡胶的单体是能够成为重要的丁二烯原料的有机化合物，特别是在轮胎产界中为重要的原料。近年来，从依赖于石油的基础化学品的生产工艺向由植物资源等可再生资源进行生产的工艺的转换技术的开发和实用化正在稳定地进行。关于1,4-丁二醇，已知例如以糖为原料采用重组大肠杆菌的生产技术(专利文献1)。图1示出1,4-丁二醇的生物合成路径的实例。即，1,4-丁二醇可以以例如琥珀酸(Succinate)或α-酮戊二酸(α-Ketoglutarate)为初始物质进行生物合成。在以琥珀酸为原材料的路径中，琥珀酸经过琥珀酰CoA(SuccinylCoA)、琥珀酸半醛(Succinylsemialdehyde)、4-羟基丁酸(4-Hydroxybutyrate)、4-羟基丁酸CoA(4-HydroxybutyrylCoA)、及4-羟基丁醛(4-Hydroxybutyraldehyde)而变换为1,4-丁二醇。催化各反应的酶分别为：(a)琥珀酰CoA合成酶(Succinyl-CoAsynthetase)、(b)CoA依赖型琥珀酸半醛脱氢酶(CoA-dependentsuccinatesemialdehydedehydrogenase)、(e)4-羟基丁酸脱氢酶(4-hydroxybutyratedehydrogenase)、(f)4-羟基丁酸CoA转移酶(4-hydroxybutyryl-CoAtransferase)、(g)4-羟基丁酸CoA还原酶(4-hydroxybutyryl-CoAreductase)、以及(h)醇脱氢酶(Alcoholdehydrogenase)(图1)。需要说明的是，所有的生物都具有(a)琥珀酰CoA合成酶。另外，还存在将琥珀酸直接转换为琥珀酸半醛的路径。该情况下，琥珀酸经过琥珀酸半醛、4-羟基丁酸、4-羟基丁酸CoA、及4-羟基丁基醛而转变为1,4-丁二醇。催化将琥珀酸转变为琥珀酸半醛的反应的酶为(c)琥珀酸半醛脱氢酶(Succinatesemialdehydedehydrogenase)(图1)。另一方面，在以α-酮戊二酸为初始物质的路径中，α-酮戊二酸经过琥珀酸半醛、4-羟基丁酸、4-羟基丁酸CoA、及4-羟基丁基醛而变换为1,4-丁二醇。对将α-酮戊二酸变换为琥珀酸半醛的反应进行催化的酶为(d)2-酮戊二酸脱羧酶(2-oxoglutaratedecarboxylase)(图1)。另外，还存在利用(i)4-羟基丁醛脱氢酶(4-hydroxybutyraldehydedehydorgenase)从4-羟基丁酸直接生成4-羟基丁醛的路径(图1)。就采用可再生的资源的生产工艺而言，其现有技术基本上是包括上述1,4-丁二醇生产技术，且依赖于有机物、特别是糖、甘油或油成分等并利用微生物的生产方法。但是，为了供给来自石油的大量基础化学品的世界性生产量，来自植物资源等的目前可使用的糖质、甘油或油成分的量中，作为微生物的碳源肯定是不足的。即，依赖于糖质或油成分并利用微生物得到的基础化学品的生产量即使在将来也是非常有限的。另外，这种工艺还存在与食物竞争的问题。合成气体(Synthesisgas,Syngas)为通过使废弃物、天然气体及煤燃烧而有效地得到的以一氧化碳、二氧化碳及氢为主成分的混合气体。以合成气体为起点并利用金属催化剂的C1化学领域中，开发出了廉价且大量地生产甲醇、甲酸、甲醛等液态化学品的工艺。而且，一氧化碳、二氧化碳及氢包含在来自废弃物的合成气体或来自工厂废气、天然气或煤的合成气体中，几乎可永久性地利用。但是，目前采用以合成气体为主的C1碳源并利用微生物进行化学品生产的实例是极少的。目前，进行开发的只是由合成气体来生产乙醇、2,3-丁二醇等。特别是与利用重组体并利用合成气体同化性生物的有关报道很少。专利文献2中，公开了利用大肠杆菌的重组体生产异丙醇的技术。该技术中，在大肠杆菌中导入多种CO代谢酶基因而赋予合成气体同化能力，由合成气体生产异丙醇。但是，该技术并不生产1,4-丁二醇。另外，使本来在合成气体同化性微生物中具有的CO代谢酶基因群在大肠杆菌中有效且高性能地表达是很困难的，而且，大肠杆菌的CO耐性也很低等等，因此，不能期待使用具有CO代谢的重组大肠杆菌的体系能够以高生产率生产目的物质。另外，在非食物类生物质中最丰富的物质为木质纤维素。木质纤维素可以通过物理、化学处理而分为纤维素、半纤维素及木质素。其中，尤其是纤维素有望作为微生物生长的有效的碳源。但是，为了高效地进行利用，则需要进一步通过物理、化学及酶的作用而将纤维素预先进行糖化，其成本高。因此，需要将纤维素更廉价地进行糖化，进一步将其变换为能量、有用物质的技术。迄今为止，没有报道由纤维素有效地生产1,4-丁二醇的技术。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特表2012-529267号公报专利文献2：日本特表2011-509691号公报
技术实现思路
专利技术所要解决的技术问题鉴于上述现状，本专利技术的目的在于，提供一种不依赖于石油、且可以由不与食物竞争的原料即纤维素或合成气体等来生产1,4-丁二醇的一系列技术。用于解决技术问题的技术方案用于解决上述的技术问题的本专利技术的1个技术方案为一种重组细胞，其为专性厌氧性且具有生成乙酸的能力的重组细胞，其具有编码选自琥珀酸半醛脱氢酶、琥珀酰CoA合成酶、CoA依赖型琥珀酸半醛脱氢酶、4-羟基丁酸脱氢酶、4-羟基丁酸CoA转移酶、4-羟基丁酸CoA还原酶、4-羟基丁醛脱氢酶以及醇脱氢酶中的至少一种酶的基因，该基因表达，该重组细胞能够生产1,4-丁二醇。如图1所示，1,4-丁二醇可以由琥珀酸生物合成。而且，本专利技术的重组细胞为专性厌氧性且具有生成乙酸的能力的重组细胞，具有编码在从琥珀酸至1,4-丁二醇的生物合成路径上起作用的酶组、即选自琥珀酸半醛脱氢酶、琥珀酰CoA合成酶、CoA依赖型琥珀酸半醛脱氢酶、4-羟基丁酸脱氢酶、4-羟基丁酸CoA转移酶、4-羟基丁酸CoA还原酶、4-羟基丁基醛脱氢酶、及醇脱氢酶中的至少一种酶的基因。而且，该基因表达，可以由选自一氧化碳、二氧化碳、甲酸、及甲醇中的至少1种C1化合物生产1,4-丁二醇。通过使用本专利技术的重组细胞，可以由例如纤维素或含有一氧化碳或二氧化碳的合成气体生产1,4-丁二醇。用于解决同样技术问题的本专利技术的其它技术方案为一种重组细胞，其为专性厌氧性且具有生成乙酸的能力的重组细胞，其具有编码选自2-酮戊二酸脱羧酶、4-羟基丁酸脱氢酶、4-羟基丁酸CoA转移酶、4-羟基丁酸CoA还原酶、4-羟基丁基醛脱氢酶及醇脱氢酶中的至少一种酶的基因，该基因表达，能够生产1,4-丁二醇。如图1所示，1,4-丁二醇也可以由α-酮戊二酸生物合成。而且，本专利技术的重组细胞为专性厌氧性且具有生成乙酸的能力的重组细胞，其具有编码从α-酮戊二酸至1,4-丁二醇的生物合成路径中起作用的酶组、即选自2-酮戊二酸脱羧酶、4-羟基丁酸脱氢酶、4-羟基丁酸CoA转移酶、4-羟基丁酸CoA还原酶、4-羟基丁醛脱氢酶、及醇脱氢酶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组细胞，其专性厌氧性且具有生成乙酸的能力，其中，所述重组细胞具有编码选自琥珀酸半醛脱氢酶、琥珀酰CoA合成酶、CoA依赖型琥珀酸半醛脱氢酶、4‑羟基丁酸脱氢酶、4‑羟基丁酸CoA转移酶、4‑羟基丁酸CoA还原酶、4‑羟基丁醛脱氢酶、以及醇脱氢酶中的至少1种酶的基因，该基因表达，所述重组细胞能够生产1,4‑丁二醇。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种重组细胞，其专性厌氧性且具有生成乙酸的能力，其中，所述重组细胞具有编码选自琥珀酸半醛脱氢酶、琥珀酰CoA合成酶、CoA依赖型琥珀酸半醛脱氢酶、4-羟基丁酸脱氢酶、4-羟基丁酸CoA转移酶、4-羟基丁酸CoA还原酶、4-羟基丁醛脱氢酶、以及醇脱氢酶中的至少1种酶的基因，该基因表达，所述重组细胞能够生产1,4-丁二醇。2.一种重组细胞，其专性厌氧性且具有生成乙酸的能力，其中，所述重组细胞具有编码选自2-酮戊二酸脱羧酶、4-羟基丁酸脱氢酶、4-羟基丁酸CoA转移酶、4-羟基丁酸CoA还原酶、4-羟基丁基醛脱氢酶、以及醇脱氢酶中的至少1种酶的基因，该基因表达，所述重组细胞能够生产1,4-丁二醇。3.如权利要求1或2所述的重组细胞，其具有由甲基四氢叶酸、一氧化碳以及CoA合成乙酰CoA的功能，所述重组细胞能够由选自一氧化碳、二氧化碳、甲酸以及甲醇中的至少1种C1化合物生产1,4-丁二醇。4.如权利要求1～3中任一项所述的重组细胞，其具有一氧化碳脱氢酶。5.如权利要求1～4中任一项所述的重组细胞，其为梭菌(Clostridium)属细菌、穆尔氏菌(Moorella)属细菌、或醋杆状菌(Acetobacterium)属细菌。6.如权利要求1或2所述的重组细胞，其具有纤维素同化性，所述重组细胞能够由木质纤维素、纤维素、或可溶性碳水化合物生产1,4-丁二醇。7.如权利要求1、2或6所述的重组细胞，其生产多纤维素酶体。8.如权利要求7所述的重组细胞，其为梭菌(Clostridium)属细菌。9.如权利要求8所述的重组细胞，其为热解纤维梭菌(Clostridiumthermocellum)、解纤维素梭菌(Clostridiumcellulolyticum)、或噬纤维梭菌(Clostridiumcellulovorans)。10.如权利要求1～9中任一项所述的重组细胞，其中，所述基因的至少之一为源自细菌的基因。11.如权利要求1～10中任一项所述的重组细胞，其中，所述基因的至少之一为源自宿主细胞的基因。12.如权利要求1～11中任一项所述的重组细胞，其中，所述基因被编入基因组。13.如权利要求1～12中任一项所述的重组细胞，其具有对至少400mM的1,4-丁二醇的耐性。14.如权利要求1～13中任一项所述的重组细胞，其中，所述重组细胞的乙醇合成能力被控制为低于宿主细胞的乙醇合成能力。15.如权利要求1～14中任一项所述的重组细胞，其中，所述重组细胞的2,3-丁二醇合成能力被控制为低于宿主细胞的2,3-丁二醇合成能力。16.一种重组细胞的制造方法，其制造重组细胞，该方法包括：第一工序，提供专性厌氧性且具有生成乙酸的能力的宿主细胞；以及第二工序，向所述宿主细胞中导入编码选自琥珀酸半醛脱氢酶、琥珀酰CoA合成酶、CoA依赖型琥珀酸半醛脱氢酶、4-羟基丁酸脱氢酶、4-羟基丁酸CoA转移酶、4-羟基丁酸CoA还原酶、4-羟基丁醛脱氢酶、及醇脱氢酶中的至少一种酶的基因，该基因表达，所述重组细胞能够生产1,4-丁二醇。17.一种重组细胞的制造方法，其制造重组细胞，该方法包括：第一工序，提供专性厌氧性且具有生成乙酸的能力的宿主细胞；以及第二工序，导入编码选自2-酮戊二酸脱羧酶、4-羟基丁酸脱氢酶、4-羟基丁酸CoA转移酶、4-羟基丁酸CoA还原酶、4-羟基丁基醛脱氢酶、以及醇脱氢酶中的至少一种酶的基因，该基因表达，所述重组细胞能够生产1,4-丁二醇。18.如权利要求16或17所述的方法，其制造重组细胞，其中，所述宿主细胞具有由甲基四氢叶酸、一氧化碳以及CoA合成乙酰CoA的功能，所述重组细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：古谷昌弘，S詹内怀恩，R费希尔，C麦克埃尔罗伊，S盖达，
申请(专利权)人：积水化学工业株式会社，弗朗霍弗应用研究促进协会，
类型：发明
国别省市：日本,JP