一种检测黄曲霉毒素B1的核酸适配体试纸条及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种检测黄曲霉毒素B1的核酸适配体试纸条及其制备方法和应用。本发明专利技术所提供的试纸条包括样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫、支撑层及配套试剂，所述配套试剂为纳米金标记的黄曲霉毒素B1适配体溶液，所述硝酸纤维素膜上有检测线和质控线，所述检测线包被生物素化探针1‑链霉亲和素溶液，所述质控线包被生物素化探针2‑链霉亲和素溶液。本发明专利技术的试纸条具有灵敏度高、特异性强、操作简单、经济实用等优点，适用于黄曲霉毒素B1残留的快速检测。

Aptamer test strip for detecting aflatoxin B1 and preparation method and application thereof

The invention discloses a nucleic acid aptamer test strip for detecting aflatoxin B1, and a preparation method and application thereof. The test paper provided by the present invention includes a sample pad, a nitrocellulose membrane, a water absorbent pad, a supporting layer and a supporting reagent. The matching reagent is a solution of aflatoxin B1 aptamer in the nanoscale gold standard, the detection line and the quality control line on the nitrocellulose membrane, and the detection line is dissolving by the biotinylated probe 1. The quality control line is coated with biotinylated probe 2 - streptavidin solution. The test strip has the advantages of high sensitivity, strong specificity, simple operation, economy and practicality, and is suitable for rapid detection of aflatoxin B1 residues.

【技术实现步骤摘要】
一种检测黄曲霉毒素B1的核酸适配体试纸条及其制备方法和应用
本专利技术涉及黄曲霉毒素B1的检测，具体涉及一种检测黄曲霉毒素B1的核酸适配体试纸条及其制备方法和应用。技术背景粮食在储存、运输和加工过程中由于温度和湿度的影响，容易滋生黄曲霉，进而产生黄曲霉毒素(aflatoxin)。黄曲霉毒素(AFT)是一类真菌(如黄曲霉和寄生曲霉)的有毒代谢产物，目前已发现20余种，它们都有致癌作用，其中黄曲霉毒素B1(AFB1)的毒性、致癌性、污染频率均居于首位，主要作用靶器官是肝脏，有强烈的致癌作用，在1993年被世界卫生组织(WHO)国际癌症研究机构认定为一级致癌物。AFB1主要存在于谷物、坚果、花生、动物饲料等相关产品中，目前有报道水中也含有黄曲霉毒素。因此，对黄曲霉毒素B1进行快速灵敏检测是保证食品安全和人们身体健康的有效措施。目前，黄曲霉毒素B1的检测方法主要包括酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫亲和柱-荧光分光光度计法(SFB)、免疫亲和柱-高效液相色谱法(IAC-HPLC)以及高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)等。其中，HPLC法测定准确，分辨率高，可同时测定多种黄曲霉毒素成分，完成定性、定量测定而被广泛应用，但由于食品样品中含有大量化合物，需要对测量样品进行净化处理以及对毒素进行富集，操作步骤繁琐，耗时费力，并且仪器价格昂贵，需要专业人员操作，不适合于大批量样品的检测；ELISA检测方法具有特异性强、样品前处理简单、成本低、能进行批量检测等优点，但由于需要酶标仪和操作熟练的人员以及检测时间相对较长，所以不适合现场快速检测。因此急需开发新的快速简单灵敏的黄曲霉毒素B1检测方法。纳米金标记免疫分析法是近年来迅速发展的一种新型分析技术，其特点是简便快速、成本低、无污染、无需培训，非常适合于现场检测。目前通常将抗体作为生物识别因子，利用抗原抗体的特异性识别进行检测，但是抗体成本较高，不方便保存，而且制备抗体时需要活体中产生免疫，批次稳定性较差。核酸适配体作为一种新型识别分子，是通过SELEX技术从1014-1018文库中筛选出来的，具有极高的亲和力和特异性，与抗体相比，具有易于合成制备、性能稳定、便于修饰等优点，已被用于多种物质的检测。因此，研制快速、灵敏、高效的黄曲霉毒素B1核酸适配体试纸条对于保障食品安全具有十分重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种检测黄曲霉毒素B1的核酸适配体试纸条。本专利技术所提供的检测黄曲霉毒素B1的核酸适配体试纸条，包括样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫、支撑层及配套试剂；所述配套试剂为纳米金标记的黄曲霉毒素B1适配体溶液，所述黄曲霉毒素B1适配体的核苷酸序列为：5’-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’，其3’端采用巯基修饰；所述硝酸纤维素膜上有检测线和质控线，所述检测线包被生物素化探针1-链霉亲和素溶液，所述探针1的核苷酸序列为：5’-GTGGGCCTAGCGAAGGGCACGAGACACAGAGAGACAACACGTGCCCAAC-3’，其3’端标记生物素；所述质控线包被生物素化探针2-链霉亲和素溶液，所述探针2的核苷酸序列为：5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’，其3’端标记生物素。所述链霉亲和素为巯基化链霉亲和素。所述样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫顺次固定在所述支撑层上。所述支撑层为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品垫为吸油纸；所述吸水垫为吸水纸。本专利技术的另一个目的是提供一种上述检测黄曲霉毒素B1的核酸适配体试纸条的制备方法，其包括步骤：1)制备纳米金标记的黄曲霉毒素B1适配体溶液；2)制备具有包被生物素化探针1-链霉亲和素溶液的检测线和包被生物素化探针2-链霉亲和素溶液的质控线的硝酸纤维素膜；3)将样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫顺次固定在支撑层上。具体地说，步骤包括：1)黄曲霉毒素B1适配体、检测线处的探针1、质控线处的探针2的选择及合成；2)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备纳米金；3)将合成的黄曲霉毒素B1适配体与制备的纳米金自组装，得到纳米金标记的黄曲霉毒素B1适配体溶液；4)分别将生物素修饰的探针1和生物素修饰的探针2与链霉亲和素溶液混合、反应，得到生物素化探针1-链霉亲和素溶液和生物素化探针2-链霉亲和素溶液；5)分别将生物素化探针1-链霉亲和素溶液和生物素化探针2-链霉亲和素溶液包被于硝酸纤维素膜的检测线(T)和质控线(C)；6)将样品垫置于含质量百分数为1％牛血清白蛋白、2％蔗糖和0.5％吐温-20的10mmol/LPBS缓冲液中浸泡2h，37℃烘2h；7)在支撑层上按顺序粘贴上样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。上述检测黄曲霉毒素B1的核酸适配体试纸条在检测黄曲霉毒素B1中的应用也是本专利技术保护的范围。本专利技术试纸条的检测原理：将样品和纳米金标记的黄曲霉毒素B1适配体溶液混合、反应，如果样品中有黄曲霉毒素B1，则黄曲霉毒素B1就会和纳米金标记的黄曲霉毒素B1适配体结合形成复合物，滴入到样品垫上后，在层析作用下一起向硝酸纤维素膜扩散。当移动到检测线时，未被样品中黄曲霉毒素B1结合的游离的纳米金标记的适配体就会和检测线上的互补DNA探针结合而显色。样品中黄曲霉毒素B1越多，剩余游离的纳米金标记的适配体就会越少，检测线处的显色强度越低，以此来检测样品中的黄曲霉毒素B1的含量。本专利技术具有以下有益效果：(1)灵敏度高。本专利技术的试纸条以纳米金标记适配体制备而成，适配体对目标靶分子具有更高的亲和力；同时去掉了传统的结合垫，让适配体和目标靶分子先预混反应，两者结合更充分，使得试纸条检测的视觉灵敏度达到0.01μg/mL，仪器检测的灵敏度可达到1.05ng/mL；(2)特异性强。本专利技术的试纸条通过选择特异性强的适配体，与其他霉菌毒素基本没有交叉，因此避免了其他霉菌毒素的干扰；(3)操作简单。使用本专利技术的试纸条检测黄曲霉毒素B1时无需其他任何试剂，只要将处理后的样品溶液与纳米金标记的黄曲霉毒素B1适配体溶液混合后滴入样品垫，20min内即可获得实验结果，可以大大提高检测效率，实现黄曲霉毒素B1的现场快速检测；(4)第一次采用巯基化链霉亲和素(GSA)代替传统野生链霉亲和素(SA)，具有更好的吸附力、高灵敏度和强稳定性。链霉亲和素是阿维丁链霉菌(Streptomycesavidinii)表达的一种小分子蛋白，与生物素具有很高的亲和力。巯基化链霉亲和素含SA的127AA最佳核心结构，每分子GSA结合4个生物素分子，国际标准比活性12-15IU/mg。由于GSA不含糖基，而且等电点接近于中性，因此GSA在检测应用中具有更低的非特异性背景。附图说明图1为试纸条剖面结构示意图。图2为试纸条俯视图。图3为试纸条检测结果判定图。图4为试纸条标准曲线图。具体实施方式下面结合具体的实施例来进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术，而不用来限制本专利技术的范围。另外，本领域的技术人员在所附权利要求书限定的范围内可能会对本专利技术进行各种改动或修饰，这些改动或修饰同样应落入本专利技术的保护范围。实施例1：检测黄曲霉毒素B1的核酸适配体试纸条的构成所述试纸条本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测黄曲霉毒素B1的核酸适配体试纸条，包括样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫、支撑层及配套试剂，其特征在于：所述配套试剂为纳米金标记的黄曲霉毒素B1适配体溶液，所述黄曲霉毒素B1适配体的核苷酸序列为5’‑GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA‑3’，其3’端采用巯基修饰；所述硝酸纤维素膜上有检测线和质控线，所述检测线包被生物素化探针1‑链霉亲和素溶液，所述探针1的核苷酸序列为5’‑GTGGGCCTAGCGAAGGGCACGAGACACAGAGAGACAACACGTGCCCAAC‑3’，其3’端标记生物素；所述质控线包被生物素化探针2‑链霉亲和素溶液，所述探针2的核苷酸序列为5’‑TTTTTTTTTTTTTTTTTT‑3’，其3’端标记生物素。

【技术特征摘要】
1.一种检测黄曲霉毒素B1的核酸适配体试纸条，包括样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫、支撑层及配套试剂，其特征在于：所述配套试剂为纳米金标记的黄曲霉毒素B1适配体溶液，所述黄曲霉毒素B1适配体的核苷酸序列为5’-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’，其3’端采用巯基修饰；所述硝酸纤维素膜上有检测线和质控线，所述检测线包被生物素化探针1-链霉亲和素溶液，所述探针1的核苷酸序列为5’-GTGGGCCTAGCGAAGGGCACGAGACACAGAGAGACAACACGTGCCCAAC-3’，其3’端标记生物素；所述质控线包被生物素化探针2-链霉亲和素溶液，所述探针2的核苷酸序列为5’-TTTTTTTT...

【专利技术属性】
技术研发人员：万宇平，张珊，董益阳，吴小胜，崔娜，张瑜，崔廷婷，赵帅，刘佳蕙，王赛，
申请(专利权)人：北京勤邦生物技术有限公司，北京化工大学，
类型：发明
国别省市：北京,11