一种玉米MS30基因突变体及其分子鉴定方法和应用技术

本发明专利技术提供一种玉米MS30基因突变体及其应用，属于基因工程技术领域。本发明专利技术将杂交玉米品种京科糯2000经钴60辐射诱变引起玉米MS30基因编码区第一外显子上的一段由第199位碱基到第607位碱基共408个碱基被AGTCTCGGTACTACTACGCCCAGTCTC碱基替换，将该MS30基因突变体命名为ms30‑4898，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，进一步证实该突变体引起玉米隐性雄性核不育，可用于制备隐性雄性核不育的转基因玉米，在玉米种质资源的遗传改良育种中作用重大。本发明专利技术还提供了该突变体的分子标记鉴定方法及其在育种制种中的应用。

A mutant of maize MS30 gene and its molecular identification method and Application

The invention provides a maize MS30 gene mutant and its application, belonging to the field of gene engineering technology. The hybrid maize variety Jingke glutinous 2000 was mutated by cobalt 60 radiation to induce a segment of the first exon of the maize MS30 gene encoding region from 199th base to 607th base to be replaced by AGTCTCGGTACTACTACGCCCAGTCTC base, and the MS30 gene mutant was named ms30 4898, and its nucleotide sequence, such as SEQ ID No.2, was named. It is proved that the mutant can cause the Recessive Male Sterility of maize, and can be used to prepare the transgenic maize with recessive male sterility, which plays an important role in the genetic improvement breeding of maize germplasm resources. The invention also provides a molecular marker identification method for the mutant and its application in breeding seed production.

【技术实现步骤摘要】
一种玉米MS30基因突变体及其分子鉴定方法和应用
本专利技术属于植物分子生物学领域，具体涉及一种玉米MS30基因突变体ms30-4898及其分子鉴定方法和应用。
技术介绍
植物雄性不育突变是自然界中十分普遍的现象，至少己在43个科、162个属的617个物种中发现了雄性不育突变体。在遗传上植物雄性不育分为细胞核雄性不育，细胞质雄性不育和细胞核细胞质互作雄性不育三大类：1)细胞核雄性不育由细胞核基因突变产生，有显性突变和隐性突变，有孢子体基因突变和配子体基因突变。显性突变和配子体基因突变只能通过雌配子遗传，隐性突变既可通过雌配子也可通过雄配子进行遗传，而且遵循孟德尔定律。目前已克隆了一些孢子体隐性核不育基因，如拟南芥的MS2，玉米的MS45和水稻的MIL1等；一些配子体隐性核不育基因也被克隆，如拟南芥的两个小孢子有丝分裂异常的突变体sidecarpollen和geminipollen；玉米上还克隆了一个孢子体显性核不育基因MS44；2)细胞质雄性不育则是由细胞质基因控制，并没有相对应的核恢复基因，属母性遗传；3)细胞核细胞质互作雄性不育由细胞质基因和细胞核基因共同控制，其实质是细胞质与细胞核遗传物质不和的结果。不育细胞质是一些由突变线粒体基因引起，但有相对应的核恢复基因，能抑制不育细胞质基因。不育细胞质基因可产生一种新的蛋白质，够影响线粒体正常功能。在育恢复基因方面，目前水稻中已经克隆了Rf-1，Rf-2，Rf-4，Rf-5基因。玉米在我国乃至全世界的粮食的粮食生产中有着举足轻重的地位，到2013年，我国玉米的总产量达到2.15亿吨，占据粮食总产量的35％，首次超过水稻成为第一大粮食作物；玉米是杂种优势利用的典范，其中杂交育种和制种技术的关键均在于母本的去雄。人工去雄相对容易，还可以通过机械去雄、化学杀雄等途径，但是这些策略也存在一些问题：一方面，这些技术大大增加了制种的成本，另一方面，因人工去雄的不彻底或不及时，会降低杂交种的纯度，造成生产上大面积减产，最终导致很大的经济损失。因此，提高杂交种种子纯度是当前玉米生产上急待解决的问题，而利用雄性不育系制种是提高杂交种质量最为有效的途径之一。玉米核雄性不育材料是一种宝贵的种质资源，对玉米杂交种生产具有极其重要的意义，但长期以来，由于纯合核雄性不育系无法繁殖保持等问题，这类材料在实际生产上几乎没有被有效地利用起来。随着新的核雄性不育材料的不断发现，玉米育种家对其进行了多方面的研究和利用尝试，如利用标记性状与不育性的紧密连锁关系，开发了粒色标记系统法、黄绿苗连锁标记法和多花丝连锁标记体系等，但是由于标记性状与不育性连锁不完全、标记性状鉴定困难、鉴定时期滞后等问题，这些方法和尝试在玉米生产上并没有得到推广应用。随着现代生物技术的迅速发展，部分玉米核雄性不育材料的不育机理逐渐明确，为分子设计创制稳定的玉米不育系奠定了理论基础。通过自然突变体鉴定和人工诱变比如物理辐射，化学处理，组织培养等方法，人们在玉米上获得了多种新的不育突变体。MS30突变体是由自然变异引起的。其雄小花变小、变白，形成不成熟的花粉粒。该突变体由MS30基因有四处核苷酸的插入或缺失引起；MS30基因有3个外显子和两个内含子，编码一个408个氨基酸的蛋白，该蛋白含有一个GDSL-Lipase结构域，研究表明GDSL-Lipase蛋白在植物花器官发育和形态建成育功能上有重要的作用；在MS30突变体植株中，小孢子细胞壁在早期液泡小孢子期发育缓慢，萌发孔出现异常，之后小孢子内形成大液泡并伴随细胞质的降解，从而导致突变体育性的丧失。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种玉米MS30基因突变体ms30-4898及其分子鉴定方法和应用。本专利技术首先对杂交种京科糯2000种子(M0代)进行钴60辐射诱变处理，种植处理的种子获M1代植株；M1代植株自交产生种子(为M2代)，种植M2代植株，对M2代植株进行形态学，组织学和遗传学鉴定，筛选不育植株；然后对不育植株进行基因测序和DNA序列分析，在分子水平上进行验证。最后获得纯合不育单株，并用于杂交育种和生物技术研究。本专利技术提供的玉米MS30基因突变体ms30-4898，其为玉米MS30基因编码区第一外显子上的一段，由SEQIDNo.1的第199位碱基到第607位碱基共408个碱基被AGTCTCGGTACTACTACGCCCAGTCTC碱基替换。如SEQIDNo.1所示的序列来自基因组版本RefGen_v1，基因登录号GRMZM2G174782。进一步地，玉米MS30基因突变体ms30-4898，其核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。本专利技术提供了含有本专利技术所述玉米MS30基因突变体ms30-4898的表达载体。本专利技术提供了含有上述表达载体的宿主细胞。本专利技术提供了玉米MS30基因突变体ms30-4898在制备转基因植物中的应用。本专利技术提供了玉米MS30基因突变体ms30-4898在制备隐性雄性核不育的转基因玉米中的应用。本专利技术提供了玉米MS30基因突变体ms30-4898在玉米改良育种、制种中的应用。本专利技术还提供了检测玉米MS30基因突变体ms30-4898的分子标记，该分子标记是由以下引物组合扩增得到，所述引物组合的核苷酸序列为：上游引物4898_F1：GAGACACGTTCTTTGGCTTCG(如SEQIDNO.3所示)下游引物4898_R1：GCGCCTCGTGGAAGAAGAG(如SEQIDNO.4所示)下游引物4898_R2：CGCGCAGTCTCGGTACGTAA(如SEQIDNO.5所示)。本专利技术提供了上述分子标记在制备隐性雄性核不育的转基因玉米中的应用。本专利技术提供了上述分子标记在玉米种质资源改良中的应用。一种玉米MS30基因突变体ms30-4898的分子标记的方法，通过下述引物组合扩增待检植物基因组DNA，并用琼脂糖电泳检测：所述引物组合的核苷酸序列为：上游引物4898_F1：GAGACACGTTCTTTGGCTTCG(如SEQIDNO.3所示)下游引物4898_R1：GCGCCTCGTGGAAGAAGAG(如SEQIDNO.4所示)下游引物4898_R2：CGCATCCCTTTCAGAGTTTCAG(如SEQIDNO.5所示)。如果用上述引物组合扩增出的产物为362bp和1330bp，则标志着该待检植物MS30基因型为野生型；如果扩增产物为922bp，则标志着该待检植物MS8基因型为ms30-4898突变体；如果扩增产物为362bp、922bp和1330bp三条带型，则标志着该待检植物MS30基因型为野生型和ms30-4898突变体的杂合基因型。本专利技术提供的突变体ms30-4898优点如下：(1)本专利技术提供了一种新的玉米隐性核雄性不育突变体，为发展新的雄性不育制种方法奠定了材料基础。(2)该突变体只影响雄性育性，造成雄性完全不育，但对雌性育性和其它农艺性状没有影响。(3)该突变体为基因内突变，不会影响MS30两侧相邻基因的功能。(4)因辐射诱变造成与野生型相比有381bp个碱基的缺失，采用实验室常用的琼脂糖电泳就能开展分子检测，即能够实现鉴别，不需要特别的检测技术和方法。(5)本专利技术的玉米Ms30基因突变体ms30-4898可直接用于杂交玉米选育和不育系本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种玉米MS30基因突变体ms30‑4898，其为玉米MS30基因编码区第一外显子上的一段，由SEQ ID No.1的第199位碱基到第607位碱基共408个碱基被AGTCTCGGTACTACTACGCCCAGTCTC碱基替换。

【技术特征摘要】
1.一种玉米MS30基因突变体ms30-4898，其为玉米MS30基因编码区第一外显子上的一段，由SEQIDNo.1的第199位碱基到第607位碱基共408个碱基被AGTCTCGGTACTACTACGCCCAGTCTC碱基替换。2.如权利要求1所述玉米MS30基因突变体ms30-4898，其核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。3.含有权利要求1或2所述玉米MS30基因突变体ms30-4898的表达载体。4.含有权利要求3所述表达载体的宿主细胞。5.权利要求1或2所述的玉米MS30基因突变体ms30-4898在制备转基因植物中的应用。6.权利要求1或2所述的玉米MS30基因突变体ms30-4898在制备隐性雄性核不育的转基因玉米中的应用。7.权利要求1或2所述的玉米MS30基因突变体ms30-4898在玉米改良育种、制种中的应用。8.检测权利要求1或2所述的玉米MS30基因突变体ms30-4898的分子标记，其特征在于，该分子标记是由以下引物组合扩增得到，所述引物组合的核苷酸序列为：上游引物4898_F1：GAGACACGT...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄培劲，龙湍，李京琳，李新鹏，王明志，曾翔，吴永忠，
申请(专利权)人：海南波莲水稻基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：海南,46